盐酸小檗碱对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌生物膜的作用

刘力娟，马立艳，孙伟，苏建荣(首都医科大学附属北京友谊医院临床检验中心，北京 100050)

鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类在内的多种抗菌药物耐药，而生物膜的形成导致鲍曼不动杆菌更能抵抗物理和化学压力[1]。生物膜产生的胞外多糖、基质蛋白和胞外DNA等分子形成的膜状复合物附着在生物体或非生生物表面，导致细菌的耐药性、致病性增强[2-3]。研究表明，鲍曼不动杆菌形成的生物膜与群体感应(quorum sensing, QS)有关[4]。目前，对于耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(cabapemne resistantAcinetobacterBaumannii, CRAB)的治疗选择主要是黏菌素和替加环素，黏菌素具有肾毒性和神经毒性，而替加环素在常规剂量无法达到治疗血流感染的血药浓度，因此，对于CRAB以及其形成生物膜的治疗急需寻找新的治疗方案。

盐酸小檗碱又称黄连素，是提取自我国传统中药黄连的具有生物活性的异喹啉类生物碱[5]。小檗碱及其衍生物具有广泛的药理作用，如抗菌、抗肿瘤、抗氧化、降压、降糖、降血脂、保护心脑血管等[6-7]。研究发现，盐酸小檗碱对白念珠菌生物膜具有抑制作用[8]，景春娥等[9]发现盐酸小檗碱有效抑制阪崎克罗诺杆菌生物膜的形成。谭俊青等[10]研究发现，中药黄连颗粒制剂可抑制鲍曼不动杆菌生物膜，但作用靶点尚不清楚。因此，本实验对收集的14株CRAB采用微量肉汤稀释法检测盐酸小檗碱的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)，探讨不同浓度的盐酸小檗碱干预对生物膜形成的影响，通过中心静脉导管体外生物膜培养并采用扫描电镜分析以及用药前后生物膜相关基因的表达差异来探讨盐酸小檗碱对CRAB生物膜的作用，为临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集首都医科大学附属北京友谊医院2021年6月—12月临床分离的14株非重复CRAB菌株。所有菌株经Vitek MS微生物质谱仪鉴定为鲍曼不动杆菌，采用Vitek 2 compact对菌株进行药敏试验。所有菌株在使用前均储存于无菌脱脂牛奶中，-80 ℃保存，实验菌株需2次传代复苏后使用。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC 27853、大肠埃希菌ATCC 8739，购自美国菌种保藏中心。

1.2仪器和试剂 微生物Vitek MS质谱仪、Vitek 2 compact全自动微生物分析仪、比浊仪(法国生物梅里埃公司)，PCR扩增仪(上海宏石公司)，梯度PCR仪、紫外分光光度计、低温离心机、恒温培养箱(美国TherrmoFisher Scientific公司)，酶联仪(美国Bio-tek公司)，扫描电镜(日本电子公司)，涡旋震荡仪(上海青浦西仪器厂)，脱色摇床(江苏其林贝尔公司)，电子天平(德国 Sartorius公司)；盐酸小檗碱标准品、二甲基亚砜(DMSO)、2.5% Gluta固定液、PBS缓冲液、噻唑蓝(MTT)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(索莱宝公司)，钙镁离子调节的M-H肉汤、Brain-Heart浸液(brain heart infusion, BHI)、哥伦比亚血平板(英国Oxoid公司)，96孔培养板(上海拱东公司)，细菌总RNA提取试剂盒、FastKing cDNA第一链合成试剂盒、SuperReal荧光定量预混试剂(Tiangen公司)，中心静脉导管包(美国箭牌)，6孔培养板(Corning costar公司)。

1.3方法

1.3.1盐酸小檗碱储存液制备 参照文献[11]，用DMSO(终浓度≤1%)溶解盐酸小檗碱干粉，加入无菌去离子水稀释至10 240 μg/mL，置于-20 ℃冷冻备用。

1.3.2药物敏感性试验 用Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪进行药物敏感性试验，按照美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)2021版推荐标准判读实验结果，替加环素结果解释标准参照EUCAST标准进行。使用96孔板采用微量肉汤稀释法[12]，用M-H肉汤倍比稀释盐酸小檗碱储存液至512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL，取100 μL加入96孔板。将0.5麦氏浊度单位浓度菌悬液(1.5×108CFU/mL)用无菌生理盐水稀释至0.5×107CFU/mL，吸取10 μL菌液加入96孔板相应孔中，菌液终浓度为0.5×105CFU/mL。每株菌设一复孔，同时设置生长对照孔和试剂对照孔，将加样后的96孔板密封放于35 ℃培养箱温育20 h，观察细菌生长情况。结果判读：以完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC值。

1.3.3生物膜形成试验 使用MTT染色法进行生物膜形成试验。取BHI 200 μL加入96孔板，制备1.0麦氏浊度单位浓度(3×108CFU/mL)菌悬液，以每孔10 μL加入96孔板中，同时每株菌设3个复孔和3个阴性对照孔，将加样后的96孔板密封放于35 ℃培养箱温育4 h取出，弃孔内上层培养液，每孔加入PBS 200 μL轻柔清洗2次，弃PBS。向每孔加入90 μL BHI及10 μL MTT，35 ℃培养箱温育4 h后取出，弃孔内液体，每孔加入110 μL甲瓒(formazan)溶解液，将96孔板置于摇床上低速振荡10 min充分溶解。使用酶联仪在490 nm处检测各孔的吸光度(A)值X和阴性对照A均值Xa，生物膜形成能力判读依据[13]：X≤Xa，阴性；Xa≤X<2Xa，弱阳性；2Xa≤X<4Xa，阳性；4Xa≤X，强阳性。

1.3.4盐酸小檗碱对CRAB生物膜的影响 根据生物膜形成能力实验测得11株CRAB菌成膜。用BHI肉汤倍比稀释盐酸小檗碱储存液至2 048 μg/mL、1 024 μg/mL、512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL，取100 μL依次加入96孔板，取100 μL BHI加入96孔板，盐酸小檗碱终浓度为1 024 μg/mL、512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL。制备1.0麦氏浊度单位浓度(3×108CFU/mL)菌悬液，以每孔10 μL加入96孔板中，同时设置生物膜阳性质控(ATCC 27853)、阴性对照组(药物加BHI培养液)和生长对照组(菌悬液加BHI培养液)，35 ℃培养24 h后MTT法检测各孔490 nm处A值，实验重复3次。

1.3.5扫描电镜分析中心静脉导管生物膜形成实验 选取生物膜强阳性菌株ab216进行中心静脉导管生物膜形成能力检测。挑取24 h培养血平板上的菌落配制成1.0麦氏浊度单位(3×108CFU/mL)溶液，用BHI肉汤10倍稀释备用。

1.3.5.1导管生物膜形成实验 用无菌剪刀将中心静脉导管剪成直径5 mm数根备用。将导管分别置于3个6孔细胞培养板中，分别标记为24 h组、48 h组和72 h组。以24 h组培养板为例，孔中加入3 mL BHI肉汤，再加入3 mL含3×107CFU/mL菌液的BHI肉汤，35 ℃静置培养24 h、48 h、72 h，其中48 h组和72 h组培养孔每隔24 h取出更换培养液。

1.3.5.2盐酸小檗碱对导管生物膜作用实验 取5根直径5 mm的导管置于6孔细胞培养板的5个孔中，每孔加入3 mL BHI肉汤，然后向各孔依次加入浓度梯度为512 μg/mL、1 024 μg/mL、2 048 μg/mL的盐酸小檗碱3 mL，使盐酸小檗碱终浓度为256 μg/mL、512 μg/mL、1 024 μg/mL。同时设置阴性对照孔(只加6 mL BHI肉汤)和生长对照孔(3×107CFU/mL菌液3 mL+3 mL BHI肉汤)，35 ℃静置培养72 h。每隔24 h更换含相应药物浓度的培养液，生长对照孔和阴性对照孔更换BHI肉汤。

1.3.5.3扫描电镜分析 培养结束将导管用PBS冲洗3～5次，将导管浸没于1 mL 2.5%Gluta固定液中4 ℃固定24 h，1%四氧化锇在室温处理30 min，酒精梯度浓度脱水后临界点干燥，将导管切开镀金后用扫描电镜成像分析导管生物膜。

1.3.6实时荧光定量PCR 选取4株成膜能力强度不同的CRAB，采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法检测用药前后生物膜相关基因abaI、bap、ompA及外排泵基因adeB、adeG、adeJ表达情况。16S rRNA作为内参，根据文献[14-18]选取相应的引物序列，引物序列信息见表1，引物由上海生工生物公司合成。根据细菌总RNA提取试剂盒说明书，提取用药前后细菌总RNA，使用紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度，按照反转录试剂盒合成第一链cDNA说明书将总RNA逆转录为cDNA，按照SuperReal荧光定量PCR预混试剂(成分为PreMix Plus和ddH2O)说明书配制20 μL反应体系(10 μL PreMix Plus，0.6 μL上游引物，0.6 μL下游引物，1 μL cDNA模板，ddH2O补足)。PCR反应条件：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，共40个循环。采用相对定量法计算目的基因的2-ΔΔCt值从而测定其相对表达量，ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值[13]。

表1 引物序列

1.4统计学分析 用SPSS 26.0软件进行。定量数据符合正态分布，用均值±标准差进行描述，用单因素方差分析比较不同药物浓度的A值差异，差异有统计学意义再使用LSD-t检验进行两两比较；用配对样本t检验比较菌株用药前后基因表达差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1抗菌药物敏感性分析 14株鲍曼不动杆菌临床分离株对碳青霉烯类、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢吡肟耐药率最高，均为100%，其次为环丙沙星耐药率85.7%，对替加环素的耐药率为14.3%，对黏菌素100%敏感。微量肉汤法药敏结果显示，盐酸小檗碱在本实验中设置的最高浓度(512 μg/mL)时不能抑制鲍曼不动杆菌的生长。

2.2MTT法检测CRAB生物膜形成以及盐酸小檗碱对生物膜作用 结果显示，14株CRAB中有11株形成生物膜，3株未形成生物膜，生物膜阳性率为78.6%。11株形成生物膜的CRAB菌株中，7株为强阳性，2株为阳性，2株为弱阳性。不同浓度的盐酸小檗碱对11株CRAB生物膜的形成实验结果显示，与生长对照组比较，盐酸小檗碱在256 μg/mL(t=2.819，P=0.006)、512 μg/mL(t=9.202，P=0.000)、1 024 μg/mL(t=18.805，P=0.000)可降低CRAB生物膜的形成。并且随着盐酸小檗碱浓度的升高，对生物膜的抑制作用增强。

2.3扫描电镜分析中心静脉导管生物膜 选取生物膜强阳性菌株ab216进行中心静脉导管生物膜形成能力检测。未用药培养24 h、48 h、72 h CRAB在中心静脉导管内表面形成的生物膜情况经扫描电镜观察，结果显示随着培养时间的延长，细胞间交联增强，72 h在导管内表面可形成成熟结构致密的生物膜。在静脉导管生物膜培养体系中分别加入256 μg/mL、512 μg/mL、1 024 μg/mL浓度的盐酸小檗碱作用72 h后，随着盐酸小檗碱浓度的升高，电镜下观察到导管表面生物膜细胞之间的交联断裂，菌体分泌的胞外物质减少或消失，包裹在菌体表面的网状结构消失。见图1。

注：A,未用药培养24 h；B,未用药培养48 h；C,未用药培养72 h；D,用药后(256 μg/mL)培养72 h，×5 000；E,用药后(512 μg/mL)培养72 h，×5 000；F,用药后(1 024 μg/mL)培养72 h，×5 000；G,用药后(1 024 μg/mL)培养72 h，×20 000；H,阴性对照(导管内表面)，×5 000。图1 扫描电镜下用药前后CRAB生物膜形成情况

2.4用药前后生物膜相关基因表达情况 4株成膜能力强度不同的CRAB菌株用药前后abaI基因表达水平差异无统计学意义；A3和ab216在用药后bap基因表达下调，而B2和C3在用药前后bap基因表达水平差异无统计学意义；A3和ab216在用药后ompA基因表达下调，而B2和C3在用药前后ompA基因表达水平差异无统计学意义；A3和B2在用药后adeB基因表达下调，C3和ab216在用药前后adeB基因表达水平差异无统计学意义；4株CRAB菌株在用药后adeG基因表达水平均下调；A3在用药后adeJ基因表达水平下调，B2、C3、ab216在用药前后adeJ基因表达水平差异无统计学意义。见表2。

表2 CRAB菌株(A3、B2、C3、ab216)用药前后生物膜相关基因abaI、bap、ompA及外排泵基因adeB、adeG、adeJ相对表达水平

3 讨论

鲍曼不动杆菌是重要的医院病原菌之一，目前碳青霉烯类抗生素是治疗耐药性不动杆菌感染的首选药物，但近年来其耐药率大幅上升。在医疗植入器械感染中，导管相关性尿路感染(catheter-associated urinary tract infections, CAUTIs)和导管相关性血流感染(catheter related blood stream infections, CRBSIs)最为常见[19]。鲍曼不动杆菌通过强大的生物膜形成能力定植在医疗设备表面，使其耐药性增强，难以清除[20]，是造成鲍曼不动杆菌耐药和复发感染的重要机制。

现代药理学研究表明，盐酸小檗碱具有抗感染、抗肿瘤、降血脂等药理作用[21]。本研究通过盐酸小檗碱对14株CRAB的体外药物敏感性试验，发现盐酸小檗碱浓度在512 μg/mL仍然不能抑制CRAB生长，表明盐酸小檗碱直接抑制或者杀灭鲍曼不动杆菌的能力非常有限。然而，在后续MTT法检测CRAB形成生物膜实验中发现盐酸小檗碱在256 μg/mL、512 μg/mL、1 024 μg/mL浓度时可以显著抑制生物膜的形成，并且随药物浓度的增高，抑制生物膜的能力增强。同时发现，盐酸小檗碱浓度在64 μg/mL时反而诱导了生物膜生长，因此体外用药时需遵循足量、足疗程的原则。本实验为体外药物实验，对于高浓度的盐酸小檗碱的不良反应、使用剂量，有待临床实验来验证。同样在中心静脉导管体外生物膜培养实验中，扫描电镜观察也发现CRAB从24 h黏附于导管表面到72 h逐渐形成成熟结构致密的生物膜。中心静脉导管经不同浓度盐酸小檗碱的处理后，扫描电镜下可以明显看出随着盐酸小檗碱的加入其菌体的黏附性降低，菌体分泌的胞外物质减少或消失，包裹在细菌表面的膜状结构消失。鲍曼不动杆菌引起的血管导管相关感染的主要治疗措施为移除导管，如果患者病情严重等原因移除导管不可行，除了进行全身抗感染治疗外，盐酸小檗碱可以为抑制生物膜的治疗提供选择。由于CRAB形成生物膜的机制复杂，本研究选择部分生物膜相关基因abaI、bap、ompA以及RND家族的外排泵基因adeB、adeG、adeJ进行研究，分析用药前后目的基因表达是否受到影响。通过对盐酸小檗碱作用24 h后的4株代表菌的目的基因表达情况进行检测，发现4株菌在盐酸小檗碱用药后外排泵基因adeG相对表达水平均显著下调，提示adeG可能是盐酸小檗碱对CRAB生物膜作用的靶点，但是本研究样本量较少，在下一步实验中会采用外排泵抑制剂验证外排泵基因adeG抑膜机制。

综上所述,盐酸小檗碱单药对CRAB体外抑菌能力较弱，但是对CRAB产生的生物膜有显著抑制作用，可联合其他抗菌药物治疗鲍曼不动杆菌引起的导管相关性感染。