miRNA-21联合尿KIM-1评价多发伤合并急性肾损伤患者预后的临床研究

盛 进 李子锋 黄 莉 张洋钒 王永剑(通讯作者)

(1 南方医科大学深圳医院 ，广东 深圳 518100 ；2 南方医科大学第三临床医学院 )

多发伤后由于创伤失血、脏器直接受损、休克、感染等多重因素影响，通常合并有急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)。据统计，急性肾损伤的病死率高达50%,多发伤后急性肾损伤患者应强调早发现、早诊断以及早治疗。而目前急性肾损伤临床常用的评估指标是血清肌酐以及尿量的变化等传统指标，而血清肌酐、尿量等指标受多种因素影响，敏感度以及特异性较低。目前较新的急性肾损伤诊断标志物等则有KIM-1，但该指标早期敏感性和特异性尚需进一步验证。Saikumar[1]等利用全球的microRNA表达谱发现在急性肾损伤大鼠的损伤组织中miR-21、miR-155和miR-18a表达高度上调。既往有研究证明，miRNA-21有抑制细胞凋亡和促进细胞增殖与迁移的重要功能[2]。而在既往多个动物实验以及临床研究中证明，miRNA-21水平在急性肾损伤中有显著改变[3-5]，但在多发伤且合并肾损伤的患者中是否存在有miRNA-21水平的变化则需要进一步的验证。本研究收集了46例2017年1月-2020年12月我院急诊科收治的多发伤合并急性肾损伤患者的临床资料，检测了其血清中miRNA-21以及尿KIM-1的水平，并与20例健康患者血清中miRNA-21以及尿KIM-1的水平进行了比较，分析了血清中miRNA-21以及尿KIM-1与患者预后的关系，现报告如下。

临床资料

1 一般资料：2017年1月-2020年12月我院急诊科收治的多发伤合并急性肾损伤患者共46例，其中：车祸伤31例，高处坠落伤15例；男性29例，女性17例；年龄25-70岁，平均年龄为(37.3±11.6)岁。另选取20例健康志愿者作为对照组，其中男性12例，女性8例；年龄21-65岁，平均年龄为(38.7±4.3)岁。2组患者性别、年龄等一般资料比较，无显著差异(P>0.05)，具有可比性。(1)入选标准：创伤类型为多发伤；受伤至入院时间不超过24小时；受伤前无明显可能影响实验结果的疾病，如恶性肿瘤等；肾损伤标准：血清肌酐升高>26.5μmol/L(0.3mg/dl)或者增加>50%，尿量<0.5mv(kg.h)且时间>6小时。(2)排除标准：有长期服药可能影响实验结果者；治疗过程中因各种原因离院以及住院24小时内死亡的患者；合并有恶性肿瘤患者；1个月内有感染病史或者入院前合并感染者。本研究得到南方医科大学深圳医院医学伦理委员会批准。

2 标本采集以及指标观察：所有观察组患者入院后即抽取外周静脉血5ml,常温下2小时内进行处理，血标本在4℃下12000*g离心10分钟，转移上层血浆至1.5ml EP管，然后在4℃下12000*g离心10分钟去除细胞成分，转移血浆至1.5ml EP管，-80℃保存以备microRNA抽取，同时抽取血清标本5ml，检测血清肌酐。另在入院时留取5ml尿液以检验KIM-1。追踪记录患者生存率等临床资料，在入院后24小时后进行APACHE II评分。

3 检测方法：RT-PCT法检测血液学中miRNA-21表达水平：每份血浆标本取200ul加入50pmol/L的cel-miRNA 395ul，然后加入20ul 5mol/L的醋酸和750ul的TRI Regent BD.RNA抽提按TRI Regent BD的操作步骤进行，抽得的RNA用40ul的无核酸酶水溶解后-80℃保存。取2ul抽得的RNA用TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit进行反转录，反应条件为16℃30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟，4℃保存。取反转录产物2ul作为模板，用TaqMan Universal Master Mix II试剂盒进行实时荧光定量PCR检测，所有反应采用三复孔，反应条件为95℃1分钟，然后95℃15秒，60℃30秒，50个循环，采用ABI7500实时定量PCR仪进行检测，Ct值用SDS2.1软件进行计算。ELISA法测定尿KIM-1，酶法测定血肌酐水平。

5 结果

5.1 2组患者miRNA-21水平比较：miRNA-21的表达水平差异是我们本次研究的重点，经过检测，观察组的miRNA-21表达水平为(10.17±1.29)，对照组的miRNA-21表达水平为(1.24±0.681)，两者比较，观察组miRNA-21表达水平明显高于对照组，2组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。具体见表1。

表1 2组miRNA-21表达水平比较

5.2 2组患者尿KIM-1、血肌酐水平比较：观察组与健康对照组相比，观察组的尿KIM-1、血肌酐水平明显高于对照组，2组比较，差异显著，差异具有统计学意义(P<0.05)。具体见表2。

表2 2组尿KIM-1、血肌酐以及尿素氮水平比较

5.3 观察组内存活患者与死亡患者miRNA-21、尿KIM-1以及血肌酐比较：观察组46例患者，经过治疗后最终有8人死亡。存活患者与死亡患者miRNA-21、尿KIM-1、血肌酐水平比较，死亡组患者明显较高，差异显著，差异具有统计学意义(P<0.05)。具体见表3。

表3 存活患者与死亡患者miRNA-21、尿KIM-1以及血肌酐比较

5.4 miRNA-21、KIM-1不同指标对于死亡预测的比较：miRNA-21、KIM-1的正常值以健康组的指标为基准。采用第1天各指标的截断值来计算预测患者死亡结局的灵敏度以及特异度。对于miRNA-21升高(≥6.7)，游离DNA升高(≥1.5μg/L)两者同时存在预测MODS最准确，相对危险度RR为6.00，特异性达99%。见表4以及图1。

表4 microRNA-21、KIM-1不同指标对于死亡预测的比较(%)

图1 microRNA-21、KIM-1不同指标对于死亡预测的比较

讨 论

肾损伤传统的标记物比如血肌酐、尿素氮等在早期缺乏一定的敏感性与特异性，近年陆续发现了多种有预测价值的肾损伤标记物，比如KIM-1、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白等。

KIM-1是Ichimura[6]等1998年在缺血-再灌注大鼠肾细胞中识别的一种新型跨膜糖蛋白，正常肾脏几乎不表达KIM-1。KIM-1在发生损伤后肾脏近曲小管上皮细胞中高表达，与肾脏损伤的严重程度相关，参与肾小管上皮细胞的早期损伤修复，具有粘附、凋亡细胞清除和参与免疫反应等功能。在本研究中，观察组KIM-1表达明显高于对照组，死亡组患者KIM-1水平亦高于存活组，说明KIM-1能较好的反应肾功能损伤严重情况。miRNA是一类由22-23个核糖核苷酸组成的内源性非编码微小RNA，通常来源于长链RNA的初始转录产物(Pri-miRNA)，其可在RNA 诱导沉默复合物引导下与互补的信使RNA(mRNA)完全或不完全性配对，从而降解或抑制mRNA转录后翻译，调控着30%以上人类基因的表达。研究发现，miRNA可存在于多种体液中，如尿液、唾液、血浆、血清等，其通过与LDL、HDL、Ago 等结合形成具有酶活性的蛋白质复合物，以凋亡小体、微囊泡、外来体等形式稳定存在于体液中不被降解，即病理状态下组织表达的miRNA通过特定途径释放入血并可稳定存在。因此，通过测定循环miRNA表达水平可一定程度上反映病理状态下特定组织的病理变化。miRNA在细胞内的表达异常，会导致下游一个或者多个靶基因的翻译或者关闭，并藉此参与肿瘤发生发展、神经系统病变和创伤后应激反应等众多生理过程。随着大通量miRNA芯片和高灵敏实时荧光定量PCR等实验手段的应用，越来越多的研究证明，miRNAs的表达异常影响肾脏细胞的增殖和凋亡，与急性肾损伤的发生和发展有关[7-8]。Saikumar[1]等利用全球的microRNA表达谱发现在急性肾损伤大鼠的损伤组织中miR-21、miR-155和miR-18a表达高度上调，血液和尿上清中的miR-21、miR-155呈现下降的表达趋势。临床试验结果表明miR-21、miR-155和miR-18a与细胞凋亡或细胞增殖相关基因有高度的相关性。同时，一些研究也证明，microRNA与急性肾损伤的关系更加复杂。Wei[2]等建立小鼠双侧肾脏I/R模型，通过微阵列分析法队肾皮质的microRNA进行分析，发现有23种microRNA的表达发生了显著变化。既往的临床研究表明，创伤后miRNA-21的表达水平在机体中有不同程度的变化[9-10]，根据既往的临床实验结果，我们选择了miRNA-21进行本次研究。miRNA21由单基因编码，在进化过程中高度保守，人类miRNA 21基因位于17号染色体短臂23区2带( 17q23. 2) 区域，该区域也是编码跨膜蛋白49( TMEM49) 基因的内含子区域。miRNA21拥有自己的启动子区域，且不受其他编码基因区域启动子的影响，只受转录和转录后的调控。成熟miRNA21的转录首先是在细胞核内由RNA聚合酶Ⅱ转录生成primiRNA21，然后经核酸内切酶Drosha酶加工成premirRNA21，最后被转运到细胞质经Dicer酶剪切为成熟的miRNA 21。成熟的miRNA21再与Argonatite家族蛋白形成的RNA诱导沉默复合体能特异性识别靶基因mRNA 3'UTR，通过抑制靶基因mRNA的翻译或促进其降解起到转录后水平的负调节作用[11]。miRNA21在哺乳动物的各种组织器官中广泛存在[12]。在本研究中，观察组miRNA-21表达明显高于对照组，死亡组患者miRNA-21水平亦高于存活组，同样证明了miRNA-21能较好的反应损伤严重情况，但miRNA-21反应损伤严重程度的敏感性以及特异性不及KIM-1。

联合检测血miRNA-21与尿KIM-1的表达水平，对于多发伤合并肾损伤的患者具有重要的评估价值，但本研究样本较少，可能存在一定的研究偏倚，希望在日后的临床工作中有更大样本量、多中心的结果来进一步验证。