新型齐墩果酸衍生物的合成及抗肿瘤活性评价

邬月娇， 孟艳秋

(沈阳化工大学 制药与生物工程学院， 辽宁 沈阳 110142)

齐墩果酸(oleanolic acid，OA)是一种五环三萜化合物，主要存在于植物中，例如橄榄、夏枯草、连翘和女贞. OA以其广泛的药理活性而闻名，包括抗病毒[1-3]、抗骨质疏松症[4-6]、抗糖尿病、抗肿瘤、抗HIV、肝保护和抗炎[7]. 但是由于其水溶性差、生物利用度低和活性低等缺点，限制了其临床应用. 齐墩果酸的结构改造方法主要围绕C-3羟基和C-28羧基等官能团进行结构改造，以合成一系列齐墩果酸衍生物[8].研究[9-11]证明，在C-2位引入醛基，在C-28位成酯、酰胺化等结构改造能使齐墩果酸的抗肿瘤活性有不同程度的提高.随着对天然产物抗肿瘤活性机制的深入了解，天然植物、中药越来越受到人们地青睐.如何寻找一种低毒、疗效稳定、使用方便且具有广谱抗肿瘤活性的药物已成为当今抗肿瘤药物研究和临床中亟待解决的问题.为了研究齐墩果酸与抗肿瘤活性之间的构效关系，提高其生物利用度，寻找更好的抗肿瘤药物，笔者对齐墩果酸的C-2位、C-3位，以及C-28位进行了结构改造，希望能有所发现.

1 目标化合物的设计

以齐墩果酸为原料将其3位羟基氧化成羰基，得到3-羰基-齐墩果烷型-12-烯-28-羧酸(OA-1)；以OA-1为原料将28位的羧基连酰氯，得到3-羰基-齐墩果烷型-12-烯-28-酰氯，然后在其28位连上胍基得到3-羰基-齐墩果烷型-12-烯-28-酰胍(OA-2).OA-2与甲酸乙酯在碱性条件下反应12 h，得到2-羟亚甲基-3-羰基-齐墩果烷-12-烯-28-酰胍(OA-3)，最后在其2位上引入苯胺和苯胺类似物，形成2-苯胺亚甲基-3-羰基-齐墩果烷-12-烯-28-酰胍类化合物R1～R5.目标化合物合成路线如下：

2 实验部分

2.1 目标化合物的合成

2.1.1 3-氧代齐墩果烷-12-烯-28-羧酸(OA-1)的制备

将齐墩果酸(0.500 g,1.095 mmol) 溶解于30 mL丙酮中，冰浴条件下缓慢滴加30滴新配置的琼斯试剂,室温反应2 h，TLC监测反应终点.加入15 mL异丙醇淬灭， 继续反应30 min.反应结束后，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥,抽滤,蒸干溶剂，得到的粗产品经硅胶柱色谱纯化[洗脱剂V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=8∶1)],得0.392 g白色固体OA-1,产率78.3%,mp 231.3～232.9 ℃.

2.1.2 3-羰基-齐墩果烷型-12-烯-28-酰胍(OA-2)的制备

取OA-1(0.500 g,1.10 mmol)，加入经无水处理后的二氯甲烷(20 mL)，搅拌溶解后加入草酰氯(0.14 mL，1.20 mmol)，加热回流，TLC监测反应终点[展开剂V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶5]，显色剂为体积分数10%的硫酸乙醇溶液.反应完毕后旋蒸除干的残余物，加入环己烷反复3次蒸除，每次15 mL.将产物充分溶于20 mL无水二氯甲烷中，充分溶解后加入吡啶(1 mL)、4-二甲氨基吡啶(0.02 g,0.16 mmol).取盐酸胍(0.11 g，1.20 mmol)溶于15 mL甲醇溶液中，搅拌溶解后加入KOH(0.07 g,1.20 mmol),反应5～10 min后对溶液进行抽滤，抽滤结束后将甲醇旋蒸，烘干后得到游离胍，其性状为白色块状固体.取产物(0.500 g,1.10 mmol)充分溶于20 mL无水二氯甲烷中，充分溶解后加入吡啶(1 mL)、4-二甲氨基吡啶(0.02 g,0.16 mmol).将上述两个体系混合反应，TLC监测反应终点[展开剂V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶5].反应结束后，用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取3次，收集上层乙酸乙酯.加入无水Na2SO4干燥4 h，抽滤，旋蒸除溶剂，放真空干燥箱60 ℃烘干，得0.472 g白色片状固体OA-2，产率86.6%.mp 213.3～217.5 ℃.

2.1.3 2-羟亚甲基-3-羰基-齐墩果烷-12-烯-28-酰胍(OA-3)的制备

取中间体OA-2(0.400 g,0.8 mmol)溶于10 mL无水甲苯溶液中，冰浴条件下加入叔丁醇钾(0.30 g，2.68 mmol)，并缓慢滴加1 mL甲酸乙酯，20 min后将温度升为室温反应12 h，TLC监测反应终点[展开剂V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶5]，显色剂为体积分数10%的硫酸乙醇溶液.反应结束后，减压蒸除甲醇溶剂，得淡黄色油状物，先用稀盐酸调pH后，加入乙酸乙酯和饱和食盐水萃取3次，留乙酸乙酯层.加入无水Na2SO4和无水MgSO4混合干燥4 h，过滤，减压蒸除溶剂，放真空干燥箱60 ℃烘干，得0.365 g淡黄色片状固体OA-3，产率84.88%.mp 172.1～177.5 ℃.

2.1.4 2-间硝基苯胺亚甲基-3-羰基-齐墩果烷-12-烯-28-酰胍(R1)的制备

取中间体OA-3(0.400 g,0.75 mmol)溶于15 mL无水乙醇中，并加入0.80 mL间硝基苯胺(0.87 g,9.34 mmol)溶液，加热回流4 h，TLC监测反应终点[展开剂V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶5]，显色剂为体积分数10%的硫酸乙醇溶液.反应结束后加入乙酸乙酯和饱和食盐水萃取3次，留乙酸乙酯层.加入无水Na2SO4干燥4 h，过滤，减压蒸除溶剂，放真空干燥箱60 ℃烘干，粗品经硅胶柱色谱纯化[洗脱剂V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=40∶1]，得0.376 g淡黄色粉末状固体R1，产率80.0%.mp 197.6～199.3 ℃.

2.1.5 2-对氯苯胺亚甲基-3-羰基-齐墩果烷型-12-烯-28-酰胍(R2)的制备

按照R1的制备方法，由中间体OA-3(0.400 g,0.75 mmol)与对氯苯胺(0.80 mL,4.95 mmol)反应.得到0.361 g白色粉末状固体R2，产率77.8%. mp 218.6～220.3 ℃.

2.1.6 2-对氟苯胺亚甲基-3-羰基-齐墩果烷型-12-烯-28-酰胺胍(R3)的制备

按照R1的制备方法，由中间体OA-3(0.400 g,0.75 mmol)与对氟苯胺(1.00 g,11.23 mmol)反应.得到0.323 g白色粉末状固体R3,产率71.5%.mp 223.1～227.9 ℃.

2.1.7 2-对硝基苯胺亚甲基-3-羰基-齐墩果烷型-12-烯-28-酰胍(R4)的制备

按照R1的制备方法，由中间体OA-3(0.400 g,0.75 mmol)与对硝基苯胺(1.00 g,11.23 mmol)反应.得到0.293 g白色粉末状固体R4，产率62.1%.mp 216.2～219.9 ℃.

2.1.8 2-对甲氧基苯胺亚甲基-3-羰基-齐墩果烷型-12-烯-28-酰胍(R5)的制备

按照R1的制备方法，由中间体OA-3(0.400 g,0.75 mmol)与对甲氧基苯胺(1.00 g,11.23 mmol)反应.得到0.288 g白色粉末状固体R5，产率62.5%.mp 204.8～210.2 ℃.

2.2 目标化合物R1～R5的结构分析

对合成的目标化合物R1～R5进行NMR分析，确证其结构.核磁数据见表1.

续表

3 生物活性测试

以阿霉素和吉非替尼为阳性对照物，选择人肺癌细胞(A549)和人胃癌细胞(SGC7901)为靶细胞，采用四甲基偶氮唑盐法(MTT比色法)测定目标化合物细胞毒活性，结果如表2所示.实验方法参见文献[11].

表2 目标化合物对SGC7901和A549细胞的抑制活性Table 2 Inhibitory activity of the target compounds on SGC7901 and A549 cell lines

从表2可以看出：所测目标化合物对SGC7901和A549细胞的生长均具有一定地抑制作用，且优于母体齐墩果酸，表明在齐墩果酸的C-2位引入苯胺亚甲基可增强活性，C-28位胍基化也具有一定地增强活性作用，带有吸电子基团的苯环可能抑制抗肿瘤活性(R4>R1>R3>R5>R2)，其中R4和R1对肿瘤细胞显示出较强的抑制作用.化合物R4对SGC7901和A549两种细胞的IC50值分别为9.6 μmol/L、21.8 μmol/L；化合物R1对SGC7901和A549两种细胞的IC50值分别为16.8 μmol/L和23.6 μmol/L.

4 结 论

笔者以 OA 为起始原料,通过在 OA-2 位引入醛基,并以此为连接臂,设计并合成了5个新的 OA 衍生物,目标化合物结构经1H-NMR、13C-NMR确证.采用 MTT法考察目标化合物的体外抗肿瘤活性,结果表明目标化合物R1～R5对A549细胞和SGC7901细胞的抑制活性明显高于 OA,说明其抗肿瘤活性显著增强.该研究结果对进一步优化设计齐墩果酸衍生物对抗肿瘤活性的研究具有一定的参考价值.