猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5 扩增产物与其克隆后测序结果的比较

董友富，蒋广志，唐伟明，王小泉，徐世富，高亚飞，孙 裴，张振东

（1.江苏科技大学生物技术学院，江苏镇江 212018；2.安徽禾丰牧业有限公司，安徽利辛 236700；3.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036）

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是一种呈球形、有囊膜的单股正链RNA病毒，属于套式病毒目（Nidovirales）动脉炎病毒科（Arteriviridae）猪动脉炎病毒属（Porartevirus），分为两个种——PRRSV1 和PRRSV2[1]。1996 年，我国分离到第一株PRRSV 毒株CH-1a。此后，PRRSV 在全国范围内快速流行、变异与演化，大量毒株被分离到，主要为PRRSV2[2]。PRRSV 基因组全长约15.4 kb，主要包括NSP1α、NSP2 等16个非结构蛋白（nonstructural protein，NSP）以及GP2a、E、GP3、GP4、GP5、M、N 和GP5a 等结构蛋白，其中GP5 蛋白编码基因常被用作PRRSV分子流行病学监测和遗传演化分析的靶基因[3]。根据GP5 蛋白编码基因序列，Shi 等[4]将PRRSV2划分为9 个谱系（lineage），而我国PRRSV2 流行毒株主要为谱系1、3、5、8[5]。近年来，谱系1 NADC30-like 毒株的传入，使得PRRSV 基因重组状况愈加复杂，因而加剧了我国PRRSV 感染的防控难度[6]。

通过扩增PRRSV ORF5 片段，采用Sanger 基因测序进而了解PRRSV 毒株流行情况的方法，在临床生产中被广泛应用，在PRRSV 的分子流行病学调查研究、诊断鉴定（追溯系统的建立）及流行控制（后备猪的免疫驯化）等多个方面发挥了重要作用。众所周知，PRRSV 作为一种RNA 病毒，在多种筛选压力下，极易变异与重组，具有明显的准种（quasispecies）现象[7-9]。临床样品中，PRRSV ORF5 片段的丰富度如何？通过RT-PCR 扩增产物直接测序能否准确反映样品中的毒株情况？能否代表致病毒株？本试验采用经典的“克隆+序列”的分析方法，对临床样品中PRRSV ORF5 片段的多样性进行了分析，以期为我国PRRSV 感染的防控提供帮助。

1 材料与方法

1.1 临床样品信息

2021年7—8月，江苏省两个规模化猪场（A、B）猪群表现出典型的PRRSV 感染症状，母猪流产比例明显升高，保育猪被毛蓬乱、消瘦、咳喘，死淘率超过10%。在A、B 两个猪场各采集1 头典型发病保育猪的肺脏、脾脏、淋巴结等组织样品，由江苏科技大学生物技术学院实验室保存备用。

1.2 RT-PCR 扩增、胶回收及连接转化

将两头猪的组织样品（A、B）分别研磨、离心，吸取240 μL 上清放于1.5 mL 的离心管中，按照杭州博日科技有限公司核酸提取试剂盒操作步骤进行RNA 提取。将提取的RNA 按照 HiScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行反转录，合成cDNA；参照先前扩增体系与条件[3]，扩增PRRSV ORF5 片段。ORF5 RT-PCR 扩增产物一部分直接送至浙江尚亚生物技术有限公司进行序列测定，一部分胶回收后克隆至pMD19-T 载体，转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，培养16～24 h 后，挑取单菌落进行培养，鉴定阳性菌液；选取15 个阳性菌落送至浙江尚亚生物技术有限公司进行序列测定。

1.3 同源性及遗传演化分析

使用DNAstar 软件中MegAligen，将获得的ORF5 序列与常见参考毒株的ORF5 序列进行核苷酸同源性分析和氨基酸序列比对；使用MEGA7.0软件中的邻接法（Neighbor-Joining），将获得的ORF5 序列与国内外常见参考毒株进行进化树绘制分析。PRRSV 参考毒株信息见表1。

表1 参考毒株信息

2 结果与分析

2.1 核苷酸及推导氨基酸同源性

对两份组织样品（A、B）研磨后抽提RNA，反转录后使用ORF5 全长序列扩增引物扩增出与目的片段大小一致的条带。将A、B 样品的两个PCR 产物及其对应的15 个亚克隆阳性菌落分别测序，共获得32 条ORF5 序列，将样品A、B 通过PCR 产物直接测序获得的ORF5 序列分别命名为A 和B 序列，通过亚克隆获得的ORF5 序列命名为A/B-n（n代表阳性菌落编号）序列。对PCR 产物及其对应的亚克隆菌落获得的序列进行比对分析。结果显示，样品A 获得的16 条序列核苷酸同源性为84.2%～100%，其中7 条序列（A-8～10、A-12、A-17～19）同源性为100%，占比43.75%（7/16）；样品B 获得的16 条序列核苷酸同源性为87.4%～100%，序列完全一致的仅有5条（B、B-1、B-13、B-16、B-21），占比31.25%（5/16）。A 序列与其15 条亚克隆序列核苷酸同源性为87.7%～97.3%，其中与A-2、A-11 同源性较低，分别为87.7%、88.7%，与其他13 条序列同源性为97.2%～97.3%；B 序列与其15 条亚克隆序列核苷酸同源性为87.9%～100%，其中与B-11同源性最低，为87.9%，与B-8、B-18～20 同源性为87.9%～88.2%，与其他10 条序列同源性为99.5%～100%。

对样品A、B 的PCR 产物及其对应的亚克隆序列推导氨基酸序列进行比对分析。结果显示：样品A 获得的16 条序列推导氨基酸同源性为86.1%～100%，其中9 条序列（A-8～10、A-12、A-17～21）的推导氨基酸同源性为100%，占比56.25%（9/16）；样品A 与其15 条亚克隆序列推导氨基酸同源性为88.5%～95.0%，其中与A-2、A-11 同源性较低，分别为88.6%、91.5%，与其他13 条序列同源性为94.5%～95.0%。样品B 获得的16 条序列推导氨基酸同源性为86.6%～100%，序列完全一致的有9 条（B、B-1、B-4、B-6、B-9、B-13、B-16、B-17、B-21），占56.25%（9/16），此外，B-19 与B-20 同源性也为100%；样品B 与其15 条亚克隆序列推导氨基酸同源性为87.6%～100%，其中与B-8、B-11、B-18 同源性最低，均为87.6%，与B-19、B-20 同源性较低，均为88.6%，与其他10 条序列的同源性为99.0%～100%。

2.2 遗传演化分析

将样品A、B 测序获得的序列与常见参考毒株的ORF5 序列进行比对并绘制遗传进化树。结果（图1）显示：样品A 与A-1、A-4 等13 条序列与经典毒株VR2332 等位于同一分支，属于谱系5，占87.50%（14/16）；A-2 与HP-PRRSV 毒株处于一个大的分支，属于谱系8，占6.25%（1/16）；A-11 与NADC30-like 毒株亲缘关系最近，属于谱系1，占6.25%（1/16）。样品B 与其亚克隆序列被划分在了谱系5、8，占比分别为68.75%（11/16）、31.25%（5/16），其中B 与B-1 等10 条亚克隆序列属于谱系5。

3 讨论

20 世纪70 年代，准种的概念被提出并应用于病毒遗传变异分析中，其是指受遗传变异、竞争、宿主选择及重组等一系列因素影响的，高度同源但不完全相同的变异株组成的动态群体[10-11]。作为一种RNA 病毒，在临床生产中药物、疫苗等多种筛选压力下，PRRSV 极易变异与演化，已有研究[12-13]证实其在猪体内以准种形式存在。Zhang等[14]从同一个猪场不同年份内分离到了基因组差异明显的毒株，进一步说明当出现具有更强适应性和增殖能力的PRRSV 毒株时，该毒种便会取代正在流行的毒株成为优势毒株。本研究采用克隆结合测序的方式，对临床样品中的PRRSV ORF5片段多样性进行了分析，样品A 与B 中分别有87.50%、68.75%序列属于谱系5，表明谱系5 毒株为PRRSV 优势毒株，但各序列之间核苷酸同源性差异较大，介于84.2%～100%，表明猪只体内曾感染过不同毒株或使用过不同种类毒株的疫苗。样品B 的PCR 产物直接测序序列与4 条亚克隆序列一致（占31.25%），与其他10 条序列划分为同一谱系（占68.75%）；样品A 的PCR 产物直接测序序列与亚克隆序列同源性最高的仅为95.0%，但与13 条序列属于同一谱系（占87.50%），表明通过PCR 产物直接测序对了解场内流行毒株具有一定的指示意义，尤其在PCR 产物直接测序出现“较乱”峰图（指出现乱峰、套峰）时。这也表明ORF5 丰富度高、准种复杂，建议采用多个亚克隆测序方式了解PRRSV 毒株情况。此外，近年来我国PRRSV 流行毒株基因复杂化程度加剧，不同谱系甚至多谱系的重组毒株越来越多，通过扩增单一片段无法真实反映动物体内数以万计序列的全貌，更不能完全代表致病性毒株[15]。因此，为更好地了解临床致病毒株的基因组序列，建议采用多片段（GP5、GP3、GP2、NSP2、NSP9 等）扩增测序分析方式，有条件时可以进行PRRSV 全基因组测序。