熟地黄治疗阿尔茨海默病作用机制的网络药理学分析＊

王 斌，吴红彦，曾庆涛，王雅乐，黄 海，宋婷婷

（广东省深圳市罗湖区中医院，深圳 罗湖 518000）

熟地黄属于玄参科植物类，性：甘、微温；归肝、肾经；功效：补血滋阴，益精填髓。现代研究揭示，熟地黄主要含有梓醇、地黄苷、地黄素、氨基酸等多种成分，可提高人体的免疫能力，具有抗氧化、提高机体记忆力、延缓机体衰老等作用，通过网络药理挖掘该药潜在的药用价值[1]。

阿尔茨海默病（Alzheimer Disease，AD）是一种神经性、退行性、不可逆转性神经系统的疾病，主要以大脑皮质层慢性退化为主要病变，以记忆力衰退、情感障碍、抽象思维力等临床特征为主。目前，美国已将AD纳入无法预防、无法治愈的十大死亡病种之一[2]。据报道，全球约4 680万AD患者，中国AD患者占比已超全球l/4，而我国老龄化人口每年在递增，同时AD患者也在递增[3]。但AD发病机理十分复杂，当前研究AD发病可能与β-淀粉样蛋白沉积、过度磷酸化Tau蛋白有不可分割的联系，包括神经炎症、神经元死亡、特异性神经递质减少和相关突触的丢失等相关的病理过程有关联[4]。目前治疗该病的药物主要以胆碱酯酶抑制剂为主[5]，如多奈哌齐、茴拉西坦、美金刚等，疗效欠佳，不良反应颇多。鉴于这种情况，探寻高效低毒、长期服用，防治AD的新型药物具有重大意义[6]。

网络药理学主要集中药药理学、计算机模拟技术、生物分子信息等为主的研究方法[7]，多层次、多途径、全方位的揭示熟地黄治疗AD的作用机制[8-10]。绘制药物-靶点-AD的网络分析图，进行关联性分析[11]；揭示了熟地黄治疗AD的核心靶点、通路及作用机制，为更深层次的研究AD提供新的思路、新的方法[12]。

1 材料与方法

1.1 熟地黄活性成分及作用靶点的获得和筛选

利用TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）计算机生物系统数据库，以“熟地黄”为关键词，检索出所有活性成分，依据ADME参数，OB≥30、DL≥0.18为筛选指标[13]。在梳理相关文献的基础上[14]，筛选出主要有效活性成分。将药物主要成分上传到UniProt中找对应名称，对名称进行矫正[15]。

1.2 网络构建图

以“AD”为检索词，英文名为“Alzheimer Disease”；从OMIM、GeneCards库中检索AD的靶点基因，将两库筛选的靶点全部合并，剔除重复靶点735个，取得AD靶点。利用R软件，将药物主要活性成分和AD靶点取交集，获取熟地黄治疗AD的靶点，绘制呈韦恩图。

1.3 网络图构建与分析

将熟地黄的主要活性成分和AD靶点取交集，获取靶点即为熟地黄治疗AD的关键基因靶点。下载Cytoscape 3.7.1软件，安装JAVA软件，将药物、靶点和疾病的文本导入软件中，绘制“药物-靶点-疾病”网络图。节点（Node）代表药物靶点，边（Edge）代表成分、靶点、疾病之间的连接。整个网络构建图呈现药物-成分-靶点-疾病之间的关联，通过网络图可以深入探究熟地黄治疗AD的作用机制。

1.4 构建PPI（Protein-ProteinInteraction）

将药物和疾病的靶点文本，导入STRING中，将筛选条件设置为“Multiple Proteins”，物种筛选设置为“Homo Sapiens”，设置最低阈值，设为“medium confidence”，将离散游离的靶点隐藏，其他参数设置为默认值，用txt将文件保存。上传至Cytoscape 3.7.1 软件，设置相关参数使连接节点的大小和颜色深浅反映度值大小，边的粗、细反映结合率分值的高低，构建PPI图。

1.5 GO注释及KEGG通路分析

运用Bioconductor生物包，安装R软件之后安装生物包，分析GO注释信息，KEGG通路分析。通过以上软件，将筛选条件设置为P＜0.05，进行通路分析，同时将通路分析结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 药物活性成分筛选

通过TCMSP筛选到药物有效活性成分共78个，以OB≥30和DL≥0.18为筛选条件，筛选出活性成分2个，见表1。

表1 熟地黄活性成分表

2.2 熟地黄治疗AD的靶点预测

从TCMSP中筛选到药物活性成分共78个，主要活性成分2个。运用GeneCards、OMIM基因库中获取AD靶点，并合并删去735个重复靶点。运用R软件，安装相应的“VennDiagram”程序包，获取交集靶点，同时绘制韦恩图（图1），得到共同靶点10个，揭示了熟地黄可通过多个靶点治疗AD。

图1 药物治疗AD靶点交集图

2.3 网络图的构建

将药物与基因靶点上传至Cytoscape3.7.1中，绘制网络作用图。整个网络构建图呈现药物-成分-靶点-疾病之间的关联，通过网络图可以深入探究熟地黄治疗AD的作用机制。见图2。

图2 药物-成分-靶点-疾病网络图

2.4 熟地黄治疗AD形成的关键靶点

将药物与疾病的靶点上传至STRING，输入药物治疗AD形成的靶点，将筛选条件设置＞0.9，将游离蛋白予以隐藏，绘制熟地黄对应的靶点PPI网络（见图3），边表示靶点作用关系；边数越多，表示该节点对应的靶点在网络中的作用越重要。揭示了CHRM1、ADRA1A、CHRM3、PGR、CHRM2、GABRA1等蛋白度值高，表明上述蛋白在疾病中的作用显著，这些蛋白将成为联系其他蛋白的纽带。

图3 关键靶点PPI网络

2.5 GO生物功能及KEGG通路分析

在R软件中安装Bioconductor生物包，整合GO、KEGG数据库进行通路富集分析。GO注释揭示了核心靶点与G蛋白偶联胺、乙酰胆碱、神经递质、G蛋白偶联5-羟色胺、血清素、G蛋白偶联神经递质等受体活性有关联，阐释了熟地黄可通过调控的生物细胞分子、基因、抑制转录进程来治疗AD（图4）。通过KEGG通路富集分析，获取6个通路图，通过设置筛选条件为q-value＜0.05，p-value＜0.05，KEGG通路分析，获取1条主要信号通路，结果见表2。富集分析图显示，主要集中在钙离子（4个基因）等信号通路上（图5）。

图5 熟地黄对AD作用靶点在钙信号通路中的作用位置

表2 KEGG 代谢通路

图4 关键靶点基因生物功能注释信息

3 讨论

AD是痴呆病中常见病、多发病之一，是神经系统疾病中仍亟须解决的热点问题之一。随着全球老龄化人口逐年的递增，AD患者也在同步递增，给老龄人的生活质量和生命周期构成了极其严重的威胁，相应地也给全球的医疗资源带来了极其严重的负担。经统计发现在治疗AD的方剂中熟地黄出现的频次较多[16]。熟地黄性甘，微温。归肝、肾经。具有补血滋阴，益精填髓之功。该药可降低Aβ神经毒性起到保护神经的作用[17]。大剂量熟地黄（雌激素）可以抑制Aβ诱导的神经元凋亡细胞。因此，我们认为熟地黄可代替雌激素作为另一种方法抑制Aβ的神经毒性作用[18]。

1987年生理学家Kha-chaturian[19]最早提出钙失调的有关假说，但最初未引起科学家们的关注。近些年，科学家们提供了充分的证据证明AD早期的病理改变与机体神经细胞内Ca2+紊乱有关联，该假说于2017年被正式提出并对现阶段的诸多疑问做了简单的概述[20]。而AD的Ca2+假说也不是单独存在，与其他假说有一定关系，钙信号通路的传导异常可破坏β-淀粉样蛋白（Aβ）的毒性、PS神经毒性作用和细胞器功能紊乱等。钙离子紊乱与钙信号通路表达异常在AD的发生、发展及演变过程中起重要作用[21]。Aβ是经γ分泌酶剪切而成的。PS成为了γ分泌酶的催化中心，因此，FAD的变异影响到γ分泌酶的相关功能[22]。但是，可以通过调节γ分泌酶的相关活性从而影响Notch的产生，可为治疗AD提供新的思路[23]。有研究表明参与肾虚AD的相关差异基因的表达主要集中在Ca2+信号通路以及细胞黏附分子等信号通路上，差异基因的相关表达主要集中在Ca2+信号通路上，揭示了Ca2+信号通路表达异常可能是肾虚AD潜在的致病机制。

综上所述，本次通过网络药理研究，揭示了熟地黄治疗AD是通过“多靶点、多成分、多通路”的调控发挥治疗作用[24]，其作用机制可能与调节钙信号通路有关，其机制可与核心靶点G蛋白偶联胺、乙酰胆碱、神经递质等受体活性相关。这为科研实验疗效评价指标的筛选提供理论依据[25]。