HPLC-MS/MS 测定猪尿中莱克多巴胺药物残留的不确定度评价

刘曙光，杨彦宁，隆雪明，陈福华，匡光伟，周 灿，欧海军

（湖南省兽药饲料监察所，湖南 长沙 410006）

随着河北某县“又见瘦肉精”事件的曝光，“瘦肉精”一词再次出现在大家视野中。瘦肉精一般泛指具有相似结构的β-肾上腺素受体激动剂（简称β-激动剂），能够抑制动物脂肪生成，促进动物生长，特别对提高畜禽瘦肉比率有明显作用。但是，β-激动剂易在动物体内积聚残留，并通过食物链进入人体，容易造成急性或慢性食肉中毒。一旦摄入量过大，对心血管系统和神经系统具有刺激作用，会引起心悸、心慌、恶心、呕吐、肌肉颤抖等临床症状，甚至可能危及生命，严重危害人类健康。莱克多巴胺是一种人工合成的β-肾上腺受体激动剂（俗称β-兴奋剂）类化合物，早在2002 年，我国就明令禁止其作为兽药和饲料添加剂在动物养殖中使用。

准确检测肉品中莱克多巴胺药物残留不仅在保障动物源性食品安全和公共卫生安全方面有重要意义，而且有助于确保养殖环节依法、科学，为兽药执法监管工作的有效开展提供有力的支撑。超高效液相色谱法常用于测定牛肉中食源性兴奋剂类药物残留[1]，该研究采用HPLC-MS/MS 测定猪尿中莱克多巴胺药物残留，采用JJF-1059—2012 测量不确定度评定与表示[2]、JJF1135—2005 化学分析测量不确定评定[3]、CNASGL006—2019 化学分析中不确定度评估指南[4]等对其结果进行不确定度评估，对不确定度各分量进行计算，找出影响检测结果不确定度的各种因素，为评定检测结果的准确性提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

HPLC-MS/MS（AB 4500Q Trap）：配有电喷雾离子源（ESI），固相萃取装置，莱克多巴胺标准品（Dr），MCX 固相萃取柱（100 mg/3 mL），β-盐酸葡萄糖苷酶/芳基硫酸酯酶、甲醇、乙酸乙酯、异丙醇、乙酸铵、氢氧化钠、甲酸（色谱纯）。

1.2 样品制备

取5 mL 猪尿样品于50 mL 离心管内，加入乙酸铵缓冲液0.5 mL（2 mol/L、pH 值5.2），加入40 μLβ-盐酸葡萄糖苷酶/芳基硫酸酯酶，涡旋，37℃避光水浴振荡16 h。酶解后，添加100 μL 100 ng/mL 内标物，涡旋，离心，pH 值调至9.8±0.2，加入10 mL 异丙醇-乙酸乙酯（6 ∶4）、1.5～2 g 固体氯化钠饱和水相，涡旋振荡，离心，重复提取一次，合并上清液，旋转蒸干，用5 mL 2 mol/L 的乙酸铵溶液（pH 值5.2）溶解。MCX 柱子活化后，去备用液全部过柱，淋洗液淋洗，5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱，洗脱液氮气吹干。残余物用0.5 mL 0.1%甲酸溶解，上机分析。基质标定量。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm 1.7 μm），柱温为40℃；进样体积10 μL，流速为0.3 mL/min，流动相A 乙腈，流动相B 为0.1%甲酸水溶液，梯度为0～2 min，体积分数为8%的B 溶液；2～6 min，体积分数为8%～60%的B 溶液，6～6.5 min，体积分数为60%～80%的B 溶液，6.5～7.5 min，体积分数为80%的B 溶液，7.5～8 min，体积分数为80%～8%的B 溶液。

1.3.2 质谱条件离子化模式为电喷雾正离子模式，质谱扫描方式为MRM，离子源温度为600℃、碰撞能量及定性定量离子质谱参数如表1 所示。

2 不确定度分析与评定

2.1 数学模型

采用基质外标法定量，按下式计算莱克多巴胺药物含量：

式中：X为样品中待测组分含量（μg/mL）；C被测样品浓度（μg/mL）；V1溶解残余物所得试样溶液体积；V2试样体积（mL）。

上述公式依据样品测定原理给出，未考虑随机因素对测量结果的影响。

2.2 不确定度来源

根据检测过程莱克多巴胺含量的计算公式，得到不确定度来源图，见图1。

图1 莱克多巴胺药物检测过程中不确定度来源

2.3 各分量标准不确定度的评估

2.3.1 测量重复性的相对标准不确定度由于分析过程中，很多操作引入的不确定度具有一定的重复性，如天平称量，移液管转移液体，容量瓶定容体积等操作等，因此，可以将此类分量进行归纳，引入重复性，即精密度，用于分析研究过程中随机变化引入的不确定度。精密度主要采用统计学方式来进行研究，对阳性样品中莱克多巴胺药物含量进行一系列平行测试，得到分析过程总随机变化，以该标准化差值的标准偏差评估试验过程的重复性不确定度。

上述分量合并研究各种随机因素，如体积读数偏差、LC-MS/MS 的变动，样品混合不均匀以及HLB固相萃取小柱对回收率的影响等，后续评定其他分量时，不再考虑各种随机因素。

表2 猪尿中莱克多巴胺含量 （mg/L）

2.3.4 标准溶液引入的不确定度

（1）标准品纯度引入的不确定度。

综上，在标准储备液配制时引入的不确定度由上述3 种组成，即：

2.3.5 标准曲线拟合引入不确定度人工配制浓度为1.00 mg/mL 莱克多巴胺储备液，稀释为0.500、1.00、2.00、5.00、10.0 ng/mL 标准系列，会引入不确定度，校正曲线为Ai=a+bCi，由工作曲线变动性引起浓度c的标准不确定度分量为：

表4 标准曲线配制过程引入的不确定度

表5 标准曲线配制过程引入的不确定度

校正曲线各个参数如表6 所示。

表6 校正曲线引入不确定度计算

2.3.6 回收率u（R）引入不确定度在空白猪尿中加入10 μg/kg 的莱克多巴胺药物，平行测定5 次，回收率结果见表7。

表7 猪尿中莱克多巴胺加标回收率测定结果及不确定度计算

2.4 合成标准不确定度

2.4.1 相对不确定度按照评定不确定度的测量模型计算莱克多巴胺含量的合成不确定度：

本次测定，样品中莱克多巴胺为1.015 mg/L，则u=uc(X)×X=1.015×0.015 4=0.015 6 mg/L

2.4.2 扩展不确定度根据国际惯例95%置信概率，取包含因子K=2，则扩展不确定度为u(x)=k×u=2×0.015 6=0.031 2 mg/L。

2.4.3 检测结果的表示用液相色谱-串联质谱测定猪尿中莱克多巴胺，结果表示为（1.015±0.031 2）mg/L，其中扩展系数为k=2。

2.5 不确定度评定

根据上述结果，制成相对不确定度直方图（图2）。由相对不确定度直方图可以看出，对莱克多巴胺结果影响最大的是urel(Cs)，即标准溶液的配制、稀释，其次是重复性操作urel(fr)及试样的体积量取urel(V1)。

图2 不确定度分量直方图

3 讨论与结论

不确定度的含义是指由于测量误差的存在，对被测量值的不能肯定的程度，反过来，也表明该结果的可信赖程度。它是测量结果质量的指标。检测试验结果表明，当猪尿中莱克多巴胺含量测定结果为1.015 mg/L 时，其扩展不确定度为0.031 2 mg/L（k=2），其中，引入不确定度主要的影响因素是标准品配制及稀释、重复性操作及试样体积量取。因此，在对猪尿中莱克多巴胺含量进行检测时，应尽量确保标准溶液配制及稀释精准，增加标准溶液的测定次数，同时多做平行样，保证重复性操作的规范性，消除系统误差带来的影响，此类不确定度分量对检测结果带来的影响，也为农产品质量安全控制提供有效的测量数据。