阻断ELISA 在小反刍兽疫抗体监测的应用

洛松西热，王玉恒，吉哈利，于子淇，胡剑武，旦增卓玛

（1.西藏自治区兽医生物药品制造厂 850000；2. 西藏自治区农业农村厅兽医局 850000；3.西藏莲茎生物科技有限公司 850000）

小反刍兽疫（Peste des petis ruminants,PPR）是由小反刍兽疫病毒（Peste des petis ruminants virus,PPRV）引起的一种小反刍兽类的急性、接触性传染病[1]，主要以发热、坏死性口炎、胃肠炎和支气管肺炎为特征，该传染病的发病率和死亡率较高[2-4]。世界动物卫生组织（OIE）规定发生该疫情必须上报，我国已将该病列入一类动物疫病。因此对小反刍兽疫疫病的防控尤为重要。抗体监测是防控重要的措施之一，可以直接反映出易感动物体内抗体水平，保护易感动物的成功率。酶联免疫吸附试验（ELSIA）是抗体监测的主要方法，但ELSIA 试剂盒的质量直接影响着抗体监测的准确性。因此本试验选用阻断ELISA 抗体检测试剂盒对免疫羊血清进行抗体监测，为基层实验室抗体监测提供帮助。

1 材料与方法

1.1 样品来源

采集于西藏自治区兽医生物药品制造厂，经小反刍兽疫活疫苗免疫的20 头2～3 月龄的西藏本地山羊。颈静脉采全血10mL，4℃1000r/min，5min 分离血清，-20℃保存。

1.2 仪器与试剂

酶标分析仪采购于北京普朗新技术有限公司，型号：DNM-9602；恒温培养箱采购于上海鸿都科技有限公司，型号：SHP-300；高速冷冻离心机采购于湖南星科科学仪器有限公司，型号：TGL16，其他耗材均为国产。

小反刍兽疫阻断ELISA 抗体检测试剂盒采购于青岛立见生物科技有限公司，批号20172107。

1.3 试验方法

1.3.1 样品稀释与加样

用样品稀释液将待检血清按1∶2 稀释，将包被板样品孔加入25μL 血清样品，再加入25μL 样品稀释液。阴性、阳性标准血清不需要稀释，在阴性、阳性对照孔内各加入50μL 阴性、阳性标准血清。酶标对照孔设立2 孔，各加入50μL 样品稀释液。封膜，震荡混匀，37℃孵育60min。

1.3.2 包被板洗涤

用蒸馏水按1∶20 稀释洗涤液。孵育结束，弃掉孔内液体。每孔加入300μL 洗涤液，洗涤4 次，弃液，在吸水纸上拍干。

1.3.3 酶标反应

每孔加入50μL酶标抗体，封板，37℃孵育30 min。按照1.3.2包被板洗涤4 次，弃液，在吸水纸上拍干。

1.3.4 显色与终止反应

每孔加入50μL 底物溶液，封板，室温避光孵育15min。

1.3.5 终止反应

每孔加50μL 终止液，于450nm 波长处测定各孔吸光值。

1.3.6 判定方法

标准样品判定：阳性对照样品抑制率（PI）=（1-阳性对照孔吸光值/酶标对照孔吸光值）×100%＞60%；阴性对照样品抑制率（PI）=（1-阴性对照孔吸光值/酶标对照孔吸光值）×100%＜40%；结果判定：样品抑制率（PI）=（1-待检样品吸光值/酶标对照孔吸光值）×100%，PI ＞50%为阳性，PI ≤50%为阴性。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2010 版软件中数据分析功能对试验羊的血清样品抗体水平进行数据分析，试验统计数据均为平均数±标准差（Mean±SD）表示。

2 结果

2.1 有效性判定

由表1 可得，阳性对照组抑制率（PI）为90.76%＞60%，阴性对照组抑制率（PI）为5.55%＜40%。根据检测试剂盒标准样品判定可得，本次试验的阳性对照组和阴性对照成立，进一步表明可根据试剂盒内结果判定标准对检测血清样品进行判定。

表1 阳性对照组和阴性对照组检测结果

2.2 抗体检测结果

由表2 可得，20 份免疫羊血清均为小反刍兽疫抗体阳性，其中平均吸光值在0.10～0.19，平均阻断率维持在80%～90%。第一次检测与第二次检测的阻断率差异性较小，进一步表明阻断ELISA 检测方法较稳定。

3 讨论

小反刍兽疫是一种急性、烈性、接触性传染病，2007 年由西藏阿里地区传入我国，并证实为境外输入疫病[5-6]，我国已将此类病列入一类动物疫病。为保护易感动物，切断传播链，免疫小反刍兽疫疫苗为主要防控措施。评价免疫效果的主要方法是抗体监测。故抗体监测对小反刍兽疫防控措施尤为重要。本试验选用阻断ELISA 抗体检测试剂盒对免疫羊血清进行抗体监测，结果显示阳性对照组抑制率（PI）为90.76%，阴性对照组抑制率（PI）为5.55%，根据检测试剂盒标准样品判定可得，本次试验的阳性对照组和阴性对照成立；20 份免疫羊血清检测均为小反刍兽疫抗体阳性，其中平均吸光值在0.10～0.19，平均阻断率维持在80%～90%。第一次检测与第二次检测的阻断率差异性较小，进一步表明阻断ELISA 检测方法较稳定。