碱性蛋白酶水解牛血清蛋白工艺研究

赵梦潇，张钰璇,2, 魏晨佳，曹 忻,2，杨具田,2，高丹丹,2★

（1.西北民族大学生命科学与工程学院 730124；2.西北民族大学生物医学研究中心 730030）

随着我国养殖业的快速发展，人们对牛肉的消费需求不断上升，其中牛血液作为屠宰加工副产品而面临着亟待解决的资源浪费问题。经研究发现，牛血液约占其活体重的4.0%～9.8%[1]，被屠宰后一般可收集到总血量60%～70%。新鲜血液中富含多种蛋白质、氨基酸、维生素，以及人体所需的无机盐与钠、钾、铁、钙等元素[2]，但由于牛血液血腥味重、消化性差、食用率不高等因素，常作为屠宰废弃物排放，不仅造成蛋白资源的浪费，还给环境带来极大的压力[3]。

牛血液中蛋白质含量在17%左右，其中以血清蛋白占比最高。畜禽动物血清蛋白水解后的多肽液易于被人体吸收利用，目前常采用酶解法水解血清蛋白制备生物活性肽，提高血液利用率和消化率。有研究报道酶解法可用于生产动物蛋白复合产品，以其低成本、高产量、生产条件温和、方便操控的优势，逐渐受到人们的青睐。Adje[4]等采用胃蛋白酶水解牛血红蛋白得到抑菌肽，汤凤霞[5]等利用酶解法水解猪血制备食用水解蛋白，胡滨[6]利用胰蛋白复合酶法水解猪血蛋白制备游离氨基酸和功能肽，多项研究证明酶解法水解动物蛋白可制备高附加值的功能性肽。由此可见，采用酶法水解动物血清蛋白制备生物活性肽具有广阔的发展前景。

本研究选用碱性蛋白酶水解蛋白，主要通过对比不同反应温度、pH、水解时间和加酶量的条件下碱性蛋白酶水解牛血清蛋白的水解度来分析水解牛血清蛋白的最适条件，通过响应面优化试验设计对水解条件进行优化分析，为解决屠宰副产物血液资源的污染问题提出新的转化思路和途径，为牛血清蛋白和多肽的综合利用奠定了实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验原材料 新鲜牛血：采自兰州忠华牛羊屠宰场18 月龄肉牛。

1.1.2 试剂 碱性蛋白酶（酶活力200 U/mg），购自上海源叶生物有限公司；茚三酮、TCA、VC，均购自美国Sigma 公司；氢氧化钠、柠檬酸钠、盐酸、正丁醇、正丙醇，均购自上海生工公司，其余均为国产分析纯试剂。

1.1.3 主要仪器 pH 计（尤尼科仪器有限公司）；HW328型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；JA2003N 电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；TGL-16M 高速台式冷冻离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；722 型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 牛血清蛋白酶解液的制备工艺 新鲜牛血→抗凝血（2.5%柠檬酸钠）→离心（4℃，6500r/min，15min）→取上清液→醇沉离心（4℃，6500r/min，15min）→取上清液冷冻干燥（-20℃）→牛血清蛋白粉→5%牛血清蛋白溶液→调节pH（pH=12）→水解（碱性蛋白酶3000 U/g，55℃，5h）→灭酶（95℃，1min）→沉降蛋白质（2mL 10% TCA）→离心（4℃，10000r/min，15min）→收集上清液保存备用。

1.2.2 水解度的测定 采用罗艳华[8]、高丹丹[9]等人的方法测定氨基酸含量。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL 质量浓度为100μg/mL 的甘氨酸标准溶液于比色管中，加水补足至2mL，分别滴加 1.2%茚三酮显色剂1mL和 1%的VC 0.1mL，混匀后95℃水浴保温15min，冷却至室温，用40%的乙醇定容至40mL，在570nm 波长处测定溶液吸光值，并根据甘氨酸含量与吸光值绘制标准曲线。得到的曲线回归方程为y=0.0081x+0.014，R2=0.9983，由数据可见，在试验取值范围内甘氨酸含量与吸光值呈良好的线性关系。

水解度（Degree of Hydrolysis，DH）的计算公式：

式中：Ah，酶解液中的总游离-NH2总量（mmol）；A0，原料蛋白中原有的总游离-NH2数（mmol）；A1，原料蛋白经强酸水解后的总游离-NH2数（mmol）。

1.2.3 单因素实验设计 为优化牛血清蛋白水解工艺，取5 mL 的5%牛血清蛋白溶液作为底物，以牛血清蛋白的水解度为指标，考察不同温度（55℃、60℃、65℃、70℃、75℃）、pH（9、10、11、12、13）、水解时间（2、3、4、5、6h）和加酶量（1000、2000、3000、4000、5000U/g）对碱性蛋白酶水解效果的影响。

1.2.4 响应面实验设计 为考察酶解温度（A）、pH（B）、水解时间（C）和加酶量（D）四个单因素对蛋白水解程度的共同影响，以牛血清蛋白的水解度为响应值设计四因素三水平响应面试验，并运用Box-Behnken 进行中心组合实验设计。响应面试验设计因素和水平见表1。

表1 响应面试验设计因素和水平

1.2.5 数 据 处 理 采 用Origin 9.0、Design-Expert.8.0.6、SPSS 25 软件对实验数据进行制图及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 温度对牛血清蛋白水解度的影响 温度对牛血清蛋白水解度的影响如图1 所示，在50℃～70℃范围内，水解度随着温度的升高呈现先增加后下降的趋势，在65℃处水解度有最大值，为16.94± 0.24%。当温度超过65℃后，水解度与温度呈负相关，这是由于超过酶解反应的最适温度会导致酶空间结构发生变化；当水解温度过高时，碱性蛋白酶还会失活，使酶解反应受到抑制[10]。这与张志翔[11]等得到的时间延长会降低水解度的实验结论相符合。所以，确定最适的水解反应温度为65℃。

图1 温度对水解度的影响

2.1.2 pH 对牛血清蛋白水解度的影响 pH 对牛血清蛋白水解度的影响如图2 所示，pH 在9 ～13 范围内，随着pH 的增加牛血清蛋白水解度呈现先升高后明显下降的趋势，在pH 值为12 时，牛血清蛋白的水解度达到最大值，为18.07 ± 0.26%，这是由于当pH 大于12 时，强碱会破坏蛋白质结构[12]，抑制蛋白酶的活性，导致水解度降低。这与邹泽斌[13]等得到的pH过大或过低均会降低蛋白质水解度的实验结论相符合。所以，确定最适的水解反应pH 为12。

图2 pH 对水解度的影响

2.1.3 水解时间对牛血清蛋白水解度的影响 水解时间对牛血清蛋白水解度的影响如图3 所示，在2 ～6h 范围内，水解度与反应时间呈正相关的趋势。在2 ～4h 内，酶解反应比较充分，牛血清蛋白的水解速率较大，而4h 后蛋白质的水解速率减慢。这是由于反应时间的延长使得反应底物减少，且酶解产物增多增强了对酶的抑制作用，从而减缓了水解反应[14]。综合考虑经济和时间因素，确定最适水解时间为4h。

图3 水解时间对水解度的影响

2.1.4 加酶量对牛血清蛋白水解度的影响 加酶量对牛血清蛋白水解度的影响如图4 所示，在1000 ～5000U/g 范围内，水解度随加酶量的变化呈正相关趋势，但当加酶量超过2000U/g后水解度增加趋势缓慢。这是由于当底物充足时，酶量的增加可以增强酶与底物的结合度，增大酶与底物的接触率，从而提高了水解程度[15]。当加酶量达到一定范围后，由于酶浓度逐渐接近饱和，底物的量不断减少，继续提高加酶量不会对水解度造成显著影响。考虑到实际生产耗能和生产成本的问题，确定最适加酶量为2000 U/g。

图4 加酶量对水解度的影响

2.2 响应面法优化碱性蛋白酶水解牛血清蛋白结果分析

2.2.1 多元二次模型方程的建立及检验 以5%牛血清蛋白溶液为反应底物，在单因素试验结果的基础上，用响应面法分析碱性蛋白酶影响牛血清蛋白水解度高低的酶解工艺，并进行四因素三水平实验设计[16-17]，采用中心Box-Behnken 组合试验设计出29 组实验，其中5 组为中心点重复实验。对温度、pH、酶解时间和加酶量四个单因素条件进行优化的试验设计及数据处理结果见表2。

表2 响应面试验设计及数据处理

根据响应面试验结果得到二次回归方程为：DH=23.19-0.20A-3.17B+1.61C+2.63D+0.033AB+0.10AC+0.13AD-0.86BC+0.14BD-0.62CD-1.72A2-4.87B2-1.56C2-2.24D2。对二次多元回归模型进行方差分析，结果如表3 所示。

表3 二次多项模型方差分析表

由上述方差分析表可知，总模型的P＜0.0001，说明该二次多元回归模型具有高度的显著性[18]。失拟项P=0.2617＞0.05，表示在失拟项α=0.05 水平上，由于非试验因素对试验结果造成的影响不显著。决定系数R2=0.9747，校正决定系数R2Adj 为0.9495，能解释实验中94.95%响应值的变化，实验误差小，说明模型有良好拟合程度，该回归方程可用于预测和代替碱性蛋白酶水解牛血清蛋白工艺研究中的试验点。

对所得回归方程的回归系数进行显著性检验，结果如表4，经比较各因素在碱性蛋白酶水解牛血清蛋白过程中对水解度的影响，得到的结果为：B、C、D 对水解度影响均达到极显著水平（P＜0.001），各因素对水解度的影响强弱为B＞D＞C＞A。

表4 回归方程系数显著性检验

2.2.2 响应面分析和优化 通过Design-Expert.8.0.6 软件对回归模型制作响应曲面图，探究温度、pH、水解时间和加酶量之间相互作用产生的影响，以交互作用对水解度的影响程度作为分析依据来确定最佳因素水平的范围。响应曲面的陡峭程度能反映出牛血清蛋白质的水解度对试验因素的敏感程度，响应面坡度平缓表示水解度对于因素的变化不敏感，坡度陡峭表示水解度对于因素的变化非常敏感[18]。由图5 可知，温度和pH、pH 和水解时间、pH 和加酶量的交互作用形成的响应曲面坡度比较陡峭，且在pH 变化方向上曲线变化明显；而温度和水解时间、温度和加酶量、水解时间和加酶量交互作用形成的曲面图则比较平缓，且在温度变化方向上曲线变化最平缓。结合显著性分析结果比较，说明pH、水解时间和加酶量的交互效应对碱性蛋白酶水解牛血清蛋白影响显著，且pH 对蛋白水解度的影响最大，温度对水解度的影响最小。

图5 两因素交互作用对水解度的曲面图

2.2.3 模型验证实验 根据Box-Behnken 试验和二次多项回归方程模型结果，在牛血清蛋白水解度达到最高值的基础上优化温度、pH、水解时间和加酶量四个因素，当实验条件为：酶解温度64.85℃、pH11.64、水解时间4.52h、加酶量2500U/g，水解度可达到24.85±0.15%。为了验证实验的准确性，在预测的最佳条件下开展水解实验，试验平行测定3 次得到的水解度结果为24.76%、25.02%、24.83%，经计算得标准偏差（SD）=0.001098，表明该模型能比较好地预测实际水解情况。

3 结论

本试验在单因素实验基础上，通过考察温度、pH、水解时间、加酶量对碱性蛋白酶水解牛血清蛋白水解度的影响，利用响应面法对影响水解条件的因素进行探究，优化碱性蛋白酶水解牛血清蛋白最佳工艺参数，考虑到实际操作条件，最终确定最佳水解条件为温度65℃、pH 11.6、水解时间4.5h、加酶量2500U/g，经优化得到的水解度可达到24.85±0.15%。本实验研究证明，响应面分析法可以有效的优化碱性蛋白酶水解牛血清蛋白工艺条件，提高牛血清蛋白的利用率和血液资源的利用，减少浪费，保护环境，防止血液污染，也给牛血清的开发和利用带来更广阔的应用前景。