鱼类内源性丝氨酸蛋白酶的研究进展

文/丁宁 谭雨青 洪惠 罗永康

随着我国水产养殖加工技术的发展与国民膳食结构不断均衡，消费者对具有优质蛋白含量高、脂肪含量低等特点的水产品消费需求日益增加。鱼丸、鱼糕和模拟蟹肉等鱼糜制品及冷冻调理食品在水产品加工行业中占据着重要地位，此类产品风味良好、食用方便的特点符合消费者需求。但鱼糜制品生产过程中的凝胶劣化效应（Modori effect）使得产品弹性下降、凝胶强度减小，在一定程度上制约了鱼糜产品市场的扩大。为阐明鱼糜在加工过程中凝胶强度下降的原因，早在20世纪80年代就有学者对此展开研究，并在鱼肌肉中发现了导致肌原纤维蛋白降解的非溶酶体蛋白酶——I型蛋白酶（丝氨酸蛋白酶），它能够在体外降解平滑肌和骨骼肌中的肌球蛋白与肌动蛋白。目前研究人员普遍认为内源性丝氨酸蛋白酶，即鱼体内自身存在的蛋白酶，尤其是肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶是鱼糜凝胶劣化的关键作用酶。

本文对鱼类内源性丝氨酸蛋白酶的性质、分离纯化及其抑制剂研究展开综述，并对目前增强鱼糜凝胶强度的方法进展进行简要介绍，以期为鱼糜制品的生产加工及其凝胶性能的改善提供理论基础。

一、内源性丝氨酸蛋白酶的性质

丝氨酸蛋白酶是一类碱性蛋白酶家族，包含胰蛋白酶、弹性蛋白酶等多种水解酶，在鱼体生理调控方面起着重要作用。丝氨酸蛋白酶因其活性丝氨酸残基Ser195能与底物发生亲和反应而得名，其活性部位是由His57、Asp102、Ser195残基构成的催化中心三联体，三个残基分别位于C端（His195）和N端结构域（Asp 102 &His 57），如图1所示（由于目前关于鱼肉中的MBSP研究有限，其三维结构并未完全阐明，因此以胰蛋白为例展示活性中心的结构）。尽管不同丝氨酸蛋白酶在进化过程中一级序列高度可变，但其核心催化结构相对保守和稳定，具有相同的催化机制。即丝氨酸蛋白酶的一般特性是通过激活活性中心进行催化，但对底物具有特异性。

图1 胰蛋白酶（PDB编号：1A0J）三维结构示意图

在鱼类肌肉中，丝氨酸蛋白酶以肌浆丝氨酸蛋白酶（Sarcoplasm serine protease，SSP）和肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（Myofibril-bound serine protease，MBSP）两种形式存在，其中肌浆丝氨酸蛋白酶可经漂洗从鱼糜中除去，而肌原纤结合型丝氨酸蛋白酶与肌原纤维蛋白稳固结合、不易洗脱，不仅能够分解肌球蛋白重链（Myosin heavy chain，MHC），且在长时间加热条件下对原肌球蛋白、辅肌动蛋白和肌动蛋白都有一定程度的降解，因此在凝胶劣化过程中起主要作用。在大多数淡水鱼中，MBSP的最适温度在50℃～55℃，最适pH值介于7.0～8.0，如表1所示。MBSP的分子量因生物种类不同而存在明显差异。在淡水鱼中，MBSP多为28kD左右的单亚基蛋白，在海水鱼中多以同源二聚体形式存在，分子量在30kD～70kD不等。图2列出了不同内源性丝氨酸酶N端氨基酸序列与草鱼胰蛋白酶的序列比对，它们表现出高度同源性，因此也称MBSP为类胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶（Trypsin-like serine protease）。

表1 不同鱼类中内源性丝氨酸蛋白酶的特性

图2 不同鱼类中丝氨酸蛋白酶与胰蛋白酶的N端氨基酸序列比对

内源性丝氨酸蛋白酶能够特异性裂解精氨酸残基的羧基端肽键，对赖氨酸残基也有一定水解作用，但不同来源的丝氨酸蛋白酶的底物特异性略有不同。在水解肽类底物时，只对特定的碱基对表现出偏好性，如在单个碱基的羧基端肽键和两个连续碱性残基（例：Arg-Arg、Lys-Arg）之间的肽键中，对Arg-Arg的水解程度最大；在水解含MCA（7-氨基-4-甲基香豆素）的荧光底物中，倾向于水解Arg或Lys的羧基端肽键。这些现象表明底物的一级结构对丝氨酸蛋白酶的降解率有重要影响。如表2所示，P1位置（从底物水解位点起，从C端至N端方向的氨基酸位点依次为P1、P2、P3等）为Arg的底物一般对鲤鱼MBSP的亲和力更高，P2处的残基种类变换产生的影响则较小。需要说明的是，由于脯氨酸导向的精氨酸裂解作用（Proline-directed arginyl cleavage），P2位置是Pro的底物对MBSP的亲和力更高。而P3位点的氨基酸残基类型会严重影响该酶对底物的水解活性，特别是P3位点为Gly时，几乎不被MBSP所水解。

表2 鲤鱼MBSP的底物特异性

二、内源性丝氨酸蛋白酶的分离纯化

关于内源性蛋白酶在凝胶降解中的作用在早些时候已被许多研究者所明确，但长期以来人们认为发挥作用的是一类热稳定碱性蛋白酶（Heatstable alkaline protease，HAP）。最早，Kinoshita从金线鱼（）中分离出一种能够有效降解肌球蛋白重链且不同于HAP的蛋白酶。主要方法是以背部肌肉匀浆后的上清液作为粗酶液，然后经过DEAE-cellulose柱、Con A-Sepharose柱和Arginine-Sepharose柱层析纯化至电泳级纯度。研究结果表明该酶是一种丝氨酸蛋白酶，在中性pH范围、50℃～70℃下具有对MHC的降解活性，并表现出类胰蛋白酶的底物特异性。随后，关于SSP的分离纯化主要是通过硫酸铵沉淀法，如Cao等在白姑鱼（）、Liu等在金线鱼（）中的分离方法。SSP在当时被认为是凝胶降解的主要原因，而Toyohara发现肌浆与肌原纤维中所含凝胶降解因子（Gel degradation-inducing factor，GIF）对凝胶的降解效果在不同鱼种中有明显不同，但洗去肌浆的肌原纤维凝胶降解更为严重，这也说明肌原纤维本身具有的GIF才是凝胶劣化现象主要因素。

1997年，Osatomi等首次在鲤鱼（）肌肉肌原纤维中分离纯化出MBSP，所采用的方法是首先提取出肌原纤维蛋白，置于高浓度盐溶液、酸性条件下分离MBSP，所得粗提液先后经过凝胶过滤层析和亲和柱层析纯化，得到电泳级纯度MBSP，分离纯化流程见图3。此后，其他淡水鱼中的MBSP都陆续得到分离纯化。Cao在酸性条件下（pH4.0）分离出鲢鱼MBSP，超滤浓缩后通过Sephacryl S-200、High-Q离子交换柱和Arginine Sepharose-4B层析柱进行纯化。由于淡水鱼和海水鱼中MBSP的一级结构、理化性质及与肌原纤维的结合方式不尽相同，提取海水鱼的方法需要在此基础上加以改进。2000年，Cao从狗母鱼（）中分离出肌原纤维，在pH6.0、55℃加热条件下处理5min得到粗酶液，先后通过阴离子交换层析、凝胶过滤层析、羟基磷灰石层析和亲和层析进行纯化得到MBSP。同样是在狗母鱼中，Ohkubo对该方法进行了一些改动，得到活性更高的MBSP。所采用的方法是在相同条件下（pH6.0，55℃）得到粗酶液后冻干，溶解于1M KCl溶液后透析，与乙醇按照7:3的比例混合、离心后取上清液，再次透析后依次进行Q-sepharose柱、Phenyl Sepharose CL-4B柱纯化。

图3 分离内源性丝氨酸蛋白酶流程图

三、鱼类丝氨酸蛋白酶的抑制剂研究

目前，许多食品添加剂、酶制剂及新型加工技术等陆续应用于鱼糜制品的生产，以提高产品的凝胶性能，其中丝氨酸蛋白酶抑制剂的添加能够显著抑制内源性丝氨酸蛋白酶的活性从而改善凝胶劣化现象。已知的丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine protease inhibitor，SPI）包括天然抑制剂和小分子化学制剂。天然丝氨酸蛋白酶抑制剂存在于动植物及微生物中，是能够引起酶活力下降的蛋白或肽，一般以具有抑制活性的亚稳态构象存在，当与靶酶结合后结构重排，形成非常稳固的共价复合物，不可逆竞争性抑制靶酶活性。对于鱼类中的丝氨酸蛋白酶来说，可根据是否来源于鱼体分为外源性抑制剂和内源性抑制剂。

（一）外源性抑制剂

胰蛋白酶抑制剂是常见的丝氨酸蛋白酶抑制剂种类之一，通过自身的P1位点与胰蛋白酶的活性中心以氢键等作用力结合而发挥抑制作用。豆类中富含胰蛋白酶抑制剂，分为Kunitz型和Bowman-Brik型，后者因其特殊的对称结构和稳定的二硫键而具有更高的蛋白酶抑制活性和耐热性，更受研究者青睐。国内外已有很多报道将豆类胰蛋白酶抑制剂（Soybean trypsin inhibitor，SBTI）用于提升鱼糜品质，结果显示加入大豆蛋白酶抑制剂、绿豆蛋白酶抑制剂等的处理组与对照组相比，抑制肌原纤维蛋白降解、增强保水能力与凝胶强度效果显著，这也有力证实了丝氨酸蛋白酶参与了鱼糜凝胶劣化过程。除了加入鱼糜中，豆类胰蛋白酶抑制剂也能够作用于其他水产品中的内源性丝氨酸酶，抑制其肌肉软化。

此外，常见的化学制剂类丝氨酸蛋白酶抑制剂有4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐（Pefabloc SC）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、抑肽酶、乙二胺四乙酸（EDTA）以及N-甲苯磺酰-L-赖氨酸-氯甲基酮（TLCK）等。在大部分研究中，Pefabloc SC、TLCK都能够抑制鱼类内源性丝氨酸酶80%以上的活性，而PMSF、EDTA及半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64的抑制率根据丝氨酸蛋白酶的来源和存在部位略有不同，混合型抑制剂相比单个抑制剂有着更好的抑制效果。

此前，还有研究从牛血浆蛋白、马铃薯淀粉等物质中提取丝氨酸蛋白酶抑制剂来抑制鱼糜凝胶劣化，但其对产品颜色和风味造成影响限制了实际的生产应用。

（二）内源性抑制剂

近年来，该领域的研究开始侧重于从鱼类自身的肌肉或其他器官中提取出特异针对某一丝氨酸蛋白酶的内源性抑制剂。Cao等首次从白姑鱼中发现一种新型的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶抑制剂（MBSPI），通过序列测定、酶学特性分析发现该MBSPI实际上是葡萄糖-6-磷酸异构酶（glucose phosphate isomerase，GPI）。类似的，鲫鱼GPI也能够特异性抑制自身MBSP，动力学研究结果显示抑制类型为可逆竞争性抑制，见图4。随后，狗母鱼中的MBSPI也得到分离纯化，能够显著抑制狗母鱼的MBSP，但在对其他酶（SSP、鲤鱼MBSP、牛胰蛋白酶等）的抑制中表现出高度的特异性，即用高浓度的MBSPI处理时，鲤鱼MBSP的活性并未受到明显影响。研究人员推测这可能与淡水鱼、海水鱼MBSP的结构差异有关。除与抑制剂结合的活性中心可能不同以外，其他位点也可能在空间上影响MBSPI与酶的相互作用。近年，还有研究者从鱿鱼卵巢中提取出SPI，以2%比例添加到印度鲭鱼鱼糜中，能够提高鱼糜的凝胶性能，且不造成负面感官影响。这类天然SPI可以替代提高凝胶强度的添加剂，在食品加工中有很大应用潜力。

图4 竞争性抑制示意图

四、总结与展望

鱼糜凝胶强度一直是影响产品适口性和消费者接受程度的重要因素，目前已确认内源性丝氨酸蛋白酶是参与鱼类肌原纤维降解的重要酶类之一，特别是在鱼糜加工中丝氨酸蛋白酶对凝胶劣化的作用最为显著，同时也是导致冷藏期间的鱼类或其他水产品肉质软化的原因之一。通过添加适当的抑制剂来降低鱼糜等水产品中的内源性丝氨酸蛋白酶活性，可以显著提升产品品质，其结合脂质、多糖等外源物添加以及超高压、微波加热等物理场技术，是未来改善凝胶性能的主要研究方向。虽然关于丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究已经十分广泛，但对内源性抑制剂的结构特性及作用机制还有待继续探索，期望下一步通过基因克隆、重组表达等手段开发新型特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂应用于鱼糜等水产品的工业生产。