昆明市禄劝县樱桃癌肿病病害调查及病原鉴定

2022-10-12杨康伍建榕王玮玮

热带林业 2022年3期

杨康，伍建榕，王玮玮

1.贵州林业勘察设计有限公司，贵州贵阳 550000；

2.西南林业大学，云南昆明 650224

1 研究区概况

昆明市禄劝县位于昆明市北部，距昆明市区90km，年平均气温15.6℃。境内气候垂直分布，最高海拔3000m，最低海拔746m。东西宽69km，南北长105km，总面积4249km2。其中，山区面积占全县总面积的98.4%。属亚热带气候，日照充足，四季如春，气候宜人，干湿季分明。禄劝县的中国樱桃成熟时间一般在4 月上中旬，要比北方产区提前1～2 个月上市，基本上在雨季到来前就已成熟，不会因为降雨导致裂果或大量落果。因此，适合发展樱桃种植业，种植出来的樱桃在市场上深受广大消费群体的喜爱，具有很大的竞争力[1]。

2 研究方法

2.1 病害的调查

该研究的样本主要在樱桃癌肿病病害发生明显的树木枝干部分上进行采集。病害标本采集后，置于黑色塑料袋内密封保存，同时记载病害采集日期和地点、采集人姓名。将采集后的标本统一带回实验室，并放置于4℃的冰箱内保存，以便于接下来对病原菌进行观察、分离、纯化以及病原菌鉴定等步骤。此次调查采用踏查的方法，于2020 年冬季对病害发生较为严重的昆明市禄劝县做进一步的了解。采取分级调查的方式调查病害的发生情况，计算发病率、病情指数[2]。

2.2 病原菌的鉴定

通过对采集的病害标本进行形态学观察、形态学鉴定、病原菌的分离培养和纯化[3]、革兰氏染色及油镜镜检[4]、病原菌的鉴定等步骤确定病原菌种类。

2.2.1 病害症状的观察

观察病害时（见图1），需要注意病害的形状、色泽等。此外，借助放大镜和解剖显微镜进行病害病症的观察，最好对病害症状拍摄照片并对其加注简明而准确的描述。

图1 野外采集的病害枝干Fig.1 Diseased Branches Collected in the Field Identification

2.2.2 形态学鉴定

（1）徒手切片：挑选病症明显的标本进行切片，好的切片要薄且透明、要有完整的组织结构。

（2）镜检：将切好的切片置于载玻片上，滴一滴蒸馏水，盖上盖玻片，先用低倍镜观察，看到切片组织后调到高倍镜观察（见图2）。

图2 形态学鉴定Fig.2 Morphological

（3）鉴定：结合病症病状，宏观与微观的形态特征，查阅相关资料进行分析。

2.2.3 病原菌的分离培养和纯化

（1）病原菌的分离：采用分离法对病菌进行分离培养（见图3），将分离出的病菌放置于LB 培养基内培养。

图3 分离培养的菌落Fig.3 Isolated and Cultured Colonies Colonies

（2）病原菌的纯化和保存：在37℃培养箱中黑暗培养3d～5d 后待到培养基长出明显的单个菌落，在无菌条件下挑选出明显的单个菌落于LB 平板上划线进行纯化培养（见图4）。制作试管斜面（见图5）：配置好的LB 培养液注入试管，约每支管的1/3体积，在灭菌后斜放于超净工作台中。在无菌条件下将LB 平板菌株的纯菌落中挑取菌落接入试管斜面中划线保存。实验完毕后将纯化的平板和斜面置于37℃恒温培养箱中培养，待长满试管的斜面后置于4℃冰箱冻存。

图4 纯化培养的菌落Fig.4 Purified Cultured

图5 试管斜面Fig.5 In Vitro Cant

2.2.4 革兰氏染色及油镜镜检

选择生长试管斜面进行革兰氏染色反应并在100 倍油镜下镜检（见图6、图7）。

图6 革兰氏染色反应Fig.6 Gram Staining eaction

图7 100 倍油镜下观察到的染色菌体Fig.7 Chromosome Seen under 100x Oil Lens

2.2.5 病原菌的鉴定

该研究主要以分子鉴定为主。其步骤按照细菌基因组DNA 试剂盒中文说明进行：

（1）将纯化培养出来的菌种取1ml～5ml 放入离心管中，向菌体沉淀中加入200μl 缓冲液GA，将离心管放在涡漩仪上振荡至菌体彻底悬浮。

（2）向管中加入20μl Proteinase K 溶液，混匀。

（3）向上述离心管中加入220μl 的缓冲液GB，振荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

（4）向上述离心管中加入220μl 的无水乙醇，充分振荡15s 以混匀实验材料，若此时出现絮状沉淀，放入离心机中离心30s 以去除管壁内的水珠。

（5）将上述所得溶液和絮状都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm（～13400×g）离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3 放入收集管中。

（6）向吸附柱CB3 中加入500μl 缓冲液GD（使用前先检查是否加入无水乙醇），12000rpm（～13400×g）离心1min，然后倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管。

（7）向吸附柱CB3 中加入600μl 漂洗液PW（使用前先检查是否加入无水乙醇），12000rpm（～13400×g）离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3 放入收集管中。

（8）重复操作步骤7。

（9）将吸附柱CB3 放回收集管中，12000rpm（～13400×g）离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3 置于室温下放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

（10）将吸附柱CB3 转入一个干净的离心管中，向吸附模的中间部位悬空滴加50ul 洗脱缓冲液TE，室温搁置2min～5min，12000rpm（～13400×g）离心2min，将液体收集到离心管中。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收率，洗脱液的pH 值对于洗脱效率有很大的影响。若用ddH2O 做洗脱效液应保证其PH 值在7.0～8.5 范围内，pH 值低于7.0 会降低洗脱效率；且DNA 产物应保存在-20℃，以防止DNA 降解。为增加基因组DNA 的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3 中，室温放置2min，12000rpm（×g）离心2min。

（11）进行PCR 反应[5]，反应体系见表1。

表1 PCR 扩增反应体系Tab.1 PCR Amplification Reaction System

PCR 扩增条件：

（12）电泳：首端BM 2000 DNA Marker，后面样本，点样孔朝向负极，各4μl，90v，电流最大，拍照（凝胶：体积25ml，浓度1%（琼脂糖0.25g，TAE 缓冲液25ml（为防止挥发加30ml）TAE 缓冲液：1000ml/50倍浓度）（见图8）。

图8 PCR 跑胶Fig.8 PCR Run Glue

（13）测序。

（14）比对：测序DNA 序列用序列在NCBI 上进行BLAST 比对。

3 结果与分析

3.1 病害调查情况

3.1.1 昆明市禄劝县樱桃癌肿病调查情况昆明市禄劝县樱桃样地调查情况

表2 樱桃癌肿病样地调查情况Tab.2 Sample Site Investigation of Cherry Wart Disease

发病率=68.75%

从以上数据了解到，调查的昆明市禄劝县樱桃癌肿病发病率和病情指数分别为68.75%、28.13%，可以得出结论，调查的样地发病率和病情指数都很高。

3.1.2 昆明市禄劝县樱桃癌肿病风险评估

通过建立指标递阶层次表，分层构造指标判断矩阵，比较各层组内的指标重要性，对各指标数值进行赋值，选出15 个指标作为林业有害生物风险评价指标，对樱桃癌肿病风险评估得出每个指标的权重如表3。

表3 樱桃癌肿病风险分析指标体系[6]Tab.3 Index System of Cherry Wart Disease Risk Analysis

目标层准则层Pij有害生物风险综合评价值R受害寄主经济重要性P4=2.5指标层Pij受害寄主的类P41=0.05受害寄主的分布面积或产量P42=2.0受害寄主的特殊经济价值P43=2.5危险性管理难度P5=2.5333检疫识别的难度P51=2.0除害处理的难度P52=2.8根除的难度P53=2.8权重等权等权

3.1.3 风险评估指标体系量化计算公式及风险分析等级划分标准

表4 风险分析指标体系采用的量化计算公式Tab.4 Table of Quantitative Calculation Formulas Adopted by Risk Analysis Index System

表5 樱桃癌肿病风险分析等级划分标准Tab.5 Classification Standard for Risk Analysis of Cherry Wart Disease

通过计算得到风险综合评价值R=2.4367，属于高度危险程度，需要引起相关部门的重视，并作出相应的预防治疗措施。

3.2 形态鉴定结果

观察病害组织外观时发现病症处粗糙并龟裂，可轻轻将瘤状物掰掉，瘤状物呈现环状出现在枝干部病，并且病部病症无霉状物，结合病害组织宏观和微观特征说明此种病害属于细菌性畸形病。

3.3 分离培养实验及植物表面灭菌效果

根据观察表6，了解到处理1min 后菌落生长最好，单个菌落数量最多。2min～3min 菌落生长数量较多，4min～5min 几乎无菌落生长。说明处理1min、2min 瘤体消毒效果好的同时又不至于杀死需要的病原菌，在分离病原菌的时候选择处理1min 和2min 瘤体是最好的，能最大程度下保留想要获得的病原菌。

表6 分离培养的实验菌落生长个数情况Tab.6 Table of Growth Number of Isolated and Cultured Experimental Colonies

3.4 革兰氏染色和油镜镜检结果

对菌体进行革兰氏染色反应后在100 倍油镜下用光学显微镜观察到菌体呈现为红色，说明此种病原菌为革兰氏阴性菌。

3.5 DNA 送检以及序列比对的结果

1#送检后获得的碱基序列：

1#多重序列对比：经过测序公司对送检样进行测序，得到的序列在NCBI 上进行BLAST 比对得到结果如下。

进一步分析致病菌的16S rDNA 序列结果表明，该菌株与Agrobacterium tumefaciens （登录号为KP050793.1）同源性最高，并且与GenBank 数据库中的Agrobacterium tumefaciens（登录号为KP050793.1）的相似度达到了99%。综合两者的结果进行分析，初步判断引起禄劝樱桃癌肿病的病原菌为Agrobacterium tumefaciens。

4 结论与讨论

4.1 结论

综上所述，引起昆明市禄劝县樱桃癌肿病的病原菌是薄壁菌门瘤菌科农杆菌属及致瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。属于好氧菌，菌体杆状，大小1μm～3μm×0.4μm～0.8μm，鞭毛周生，有1～4 根鞭毛，革兰氏染色阴性，无芽孢，能形成荚膜。只有携带Ti 质粒的菌株才具有致病性，Ti 质粒同时还控制对细菌素的抗感性和寄主范围。Ti 质粒可以用热处理或其他因素丢失，使细菌失去致病力。

4.2 讨论

4.2.1 侵染循环

据昆明市禄劝县癌肿病病害年年发病并且有增长的趋势及病原菌的生活习性可知，此病原菌存在侵染循环（包括初次侵染、再次侵染、传播媒介、越冬场所）。

（1）初次侵染：病菌主要通过伤口侵入，随后气温的升高和降雨的增多，到6～8 月份开始大面积的发病。

（2）再次侵染：在适宜的温度范围内，温度18℃～22℃时，尤其是在降水偏多的6～8 月份，适合癌瘤的形成和发展，是病害爆发的高峰时期。

（3）传播媒介：癌肿病病菌通过风、雨水、病残体、虫类、嫁接工具、作业农具等进行传播，带病种苗和种条调运带菌是远距离传播的重要途径。

（4）越冬场所：病菌主要在病瘤内或土壤和土壤中的寄主残体内越冬。

4.2.2 发病规律春季是樱桃采摘的季节，采摘过程中造成茎杆的损伤，易导致病菌侵入，而春季病害发生较少，没有引起种植户的重视，一般都没有进行病害防治，为夏季病害的大爆发提供了条件。夏季6 月～8 月温暖潮湿，特别是昆虫活动频繁易造成此病大爆发，病害的传播速度最快，是一年当中发病率最高的时期，是病害防治过程中的重点防治时期。秋季樱桃生长缓慢并趋于停止，抗病能力较强，病害的发生同样较少。冬季病原菌在肿瘤内越冬，是来年病害发生的侵染源，然而种植户冬季并没有及时进行病株、病叶的清理，是导致来年发病更严重的主要原因。