生脉注射液化学物质基础研究<br/>——大类成分的定量分析

生脉注射液化学物质基础研究
——大类成分的定量分析

2022-10-12聂黎行马双成

食品与药品 2022年5期

聂黎行，刘瑞，张烨，陈佳*，李静，戴忠，马双成

（1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.山西中医药大学，山西晋中 030619；3.鄂尔多斯市检验检测中心，内蒙古鄂尔多斯 017010）

中药注射剂作为我国特有的新剂型，具有起效快、作用强等特点，在心脑血管疾病、感染性疾病、恶性肿瘤、危重疾病、疑难杂症的治疗方面具有独特优势[1-3]。生脉注射液由红参、麦冬、五味子3味药组成，具有益气养阴，复脉固脱的功效，临床上用于气阴两亏，脉虚欲脱的心悸、气短，四肢厥冷、汗出、脉欲绝及心肌梗塞、心源性休克、感染性休克等疾病的治疗[4-6]。本次新型冠状病毒肺炎疫情，中医药在缓解症状、提高治愈率、降低病亡率，促进机体康复等环节取得明显成效[7-9]，生脉注射液也被列为《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》（第四～七版）重型患者救治推荐用药。

中药的化学成分是其发挥临床功效的物质基础，《中药、天然药物注射剂基本技术要求》（国食药监注[2007]743号）规定：“中药注射剂中所含成分应基本清楚，多成份制成的注射剂，需要分别建立大类成份的测定，所测成份应大于总固体量的80 %”。本文在前期化学成分类别系统预实验的基础上[10]，采用多种技术和手段首次对生脉注射液中的大类成分进行全面地定量分析，进一步阐明了本品的化学物质基础，为其质量评价和控制、药效及作用机制等研究提供了依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

AE240（十万分之一）电子天平，FD-1冷冻干燥机（北京博医），DZ-2BC型真空干燥箱（天津泰斯特），KQ-250DE型医用数控超声波清洗器（昆山市超声仪器公司），8453紫外可见分光光度计（Agilent公司），L15/11马弗炉（Nabertherm公司），DL53型自动电位滴定仪（Mettler公司）。

1.2 材料

分析纯乙醇、乙酸乙酯、盐酸、硫酸、蒽酮、香草醛（北京化学试剂公司）。氢氧化钠滴定液（0.01004 mol/L，国家化学试剂质检中心）。AB-8型大孔树脂（天津允开树脂），001*1型阳离子交换树脂（天津兴南允能）。D-果糖（批号：111504-201703）、人参皂苷Re（批号：110754-202129）、五味子醇甲（批号：110857-201815）、苹果酸（批号：190013-201702）对照品（中国食品药品检定研究院）。7批生脉注射液由A、B、C 3个厂家提供。

2 方法与结果

2.1 总固体的测定

因生脉注射液含糖量高，如采用常规的烘干法测定总固体，糖在高温下分解产生水，水蒸发后造成总固体量偏低，故采用冷冻-减压干燥法测定。精密量取本品2.0 ml于干燥置入恒重的西林瓶，-20 ℃冷冻干燥48 h，取出，置于装有五氧化二磷的真空干燥箱中，室温放置24 h，取出，迅速精密称定重量，计算总固体含量，结果见表1。

2.2 大类成分的定量分析

2.2.1 总糖的含量测定样品经大孔树脂纯化，采用蒽酮-硫酸比色法测定生脉注射液中总糖含量[11]。取果糖对照品12 mg，精密称定，加水溶解并定容至10 ml，即得对照品贮备液。精密吸取上述对照品贮备液0.2，0.4，0.8，1.0和1.2 ml，分别加水稀释并定容至10 ml，摇匀，即得系列对照品溶液。分别吸取各系列对照品溶液1 ml，精密加水1 ml，摇匀，精密加入硫酸蒽酮溶液（精密称取蒽酮0.1 g，加80 %硫酸溶液100 ml使溶解，摇匀）6 ml，摇匀。至100 ℃水浴加热15 min，立即至冰浴中冷却15 min，取出测定。照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2020年版四部通则0401），以相应试剂为空白，在626 nm波长处测定吸光度。以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。精密量取生脉注射液1 ml，加于预先处理好的AB-8大孔树脂柱（柱内径约8 mm，高约19 cm），用水80 ml冲洗，洗脱液收集于100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取上述溶液2 ml，加水稀释并定容至10 ml，摇匀，即得供试品溶液。精密量取供试品溶液1 ml，照标准曲线制备项下的方法，依法测定吸光度，以随行标准曲线外标法计算含量，结果见表1。

方法学考察：按标准曲线制备方法，进行线性关系实验，结果表明，果糖在0.0250～0.1504 mg/ml范围内线性关系良好，回归方程为y=5.773x+0.009，r=0.9996。取同一供试品溶液（批号：09122603），分别连续测定6次，平均吸光度为0.5146，RSD为0.1 %，表明方法精密度良好。取同一批次样品（批号：09122603），平行制备6份供试品溶液，依法测定，总糖含量平均值为43.12 mg/ml，RSD为1.3 %，表明方法重复性良好。取显色后的同一供试品溶液（批号：09122603），置于冰浴中，分别于15，30，60，90，120，150，180 min取出测定，平均吸光度为0.5185，RSD为0.4 %，表明供试品溶液冰浴放置3 h，基本稳定。精密量取已知含量的本品（批号：09122603）0.5 ml，精密加入果糖对照品约25 mg，混匀，按供试品制备方法制得加样回收溶液，平行制备6份，依法测定，平均回收率为101.2 %，RSD为2.4 %，表明方法准确。

2.2.2 总皂苷的含量测定样品经大孔树脂纯化，采用香草醛-硫酸比色法测定生脉注射液中总皂苷含量[12]。取人参皂苷Re对照品17.5 mg，精密称定，加甲醇溶解并定容至10 ml，即得对照品贮备液。精密量取上述对照品贮备液1 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。精密量取对照品溶液0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 ml，置入具塞试管，挥发溶剂至干，精密加入8 %香草醛乙醇溶液0.5 ml、72 %硫酸5.0 ml，摇匀，60 ℃水浴加热1 h，置冰浴中冷却15 min，取出，放至室温。照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2020年版四部通则0401），以相应试剂为空白，在538 nm波长处测定吸光度。以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。精密量取生脉注射液1 ml，加于预先处理好的AB-8大孔树脂柱（柱内径约8 mm，高约19 cm），分别用水80 ml，20 %乙醇40 ml冲洗，再用75 %乙醇70 ml洗脱，收集75 %乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至25 ml量瓶，稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。精密量取供试品溶液1 ml，照标准曲线制备项下的方法，依法测定吸光度，以随行标准曲线外标法计算含量，结果见表1。

方法学考察：按标准曲线制备方法，进行线性关系实验，结果表明，人参皂苷Re在0.0155～0.1399 mg/ml范围内线性关系良好，回归方程为y=7.026x+0.002，r=0.9996。取同一供试品溶液（批号：09122603），分别连续测定6次，平均吸光度为0.4812，RSD为0.2 %，表明方法精密度良好。取同一批次样品（批号：09122603），平行制备6份供试品溶液，依法测定，人参皂苷Re含量平均值为1.97 mg/ml，RSD为1.8 %，表明方法重复性良好。取显色并冰浴冷却后的同一供试品溶液（批号：09122603），置于室温，分别于15，30，60，90，120，150，180 min测定，平均吸光度为0.5372，RSD为2.0 %，表明供试品溶液冰浴放置3 h，基本稳定。精密量取已知含量的本品（批号：09122603）0.5 ml，精密加入人参皂苷Re对照品约0.9 mg，混匀，按供试品制备方法制得加样回收溶液，平行制备6份，依法测定，平均回收率为101.8 %，RSD为2.4 %，表明方法准确。

2.2.3 总木脂素的含量测定样品经大孔树脂柱分离和乙酸乙酯萃取，采用比色法测定生脉注射液中总木脂素含量[13]。取五味子醇甲对照品10 mg，精密称定，加甲醇溶解并定容至25 ml，摇匀，即得对照品溶液。分别精密量取上述对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度。照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2020年版四部通则0401），以相应试剂为空白，在254 nm波长处测定吸光度。以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。精密量取本品1 ml，加于预先处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱（柱内径约8 mm，高约19 cm），分别用水200 ml、20 %乙醇200 ml、乙醇100 ml洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣加水10 ml使溶解，再加5 mol/L的盐酸溶液0.5 ml，摇匀，用乙酸乙酯萃取4次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10 ml，摇匀，即得供试品溶液。精密量取供试品溶液1 ml，照标准曲线制备项下的方法，依法测定吸光度，以随行标准曲线外标法计算含量，结果见表1。

方法学考察：按标准曲线制备方法，进行线性关系实验，结果表明，五味子醇甲在0.0045～0.0452 mg/ml范围内线性关系良好，回归方程为y=3.349x+0.030，相关系数（r）=0.9996。取同一供试品溶液（批号：09122603），分别连续测定6次，平均吸光度为0.1543，RSD为0.04 %，表明方法精密度良好。取同一批次样品（批号：09122603），平行制备6份供试品溶液，依法测定，总木脂素含量平均值为0.17 mg/ml，RSD为0，表明方法重复性良好。取同一供试品溶液（批号：09122603），分别于15，30，60，90，120，150，180 min测定，平均吸光度为0.1547，RSD为0.3 %，表明供试品溶液放置3 h，基本稳定。精密量取已知含量的本品（批号：09122603）0.5 ml，精密加入五味子醇甲对照品约0.08 mg，混匀，按供试品制备方法制得加样回收溶液，平行制备6份，依法测定，平均回收率为95.9 %，RSD为2.7 %，表明方法准确。

2.2.4 总酸的含量测定采用电位滴定法测定总酸含量[14-15]。取苹果酸对照品25 mg，精密称定，加水溶解并定容至50 ml，摇匀，即得对照品溶液。精密量取上述对照品溶液1 ml，加水30 ml，置于自动电位仪上，用氢氧化钠滴定液滴定（电极DG 111-SC），随行空白实验。扣除空白后，求得每1 ml苹果酸对照品溶液所消耗的氢氧化钠滴定液体积为7.54 ml。而苹果酸含3个羧基，由公式（V碱=3C酸V酸/C碱）计算理论消耗量为7.46 ml，实测值与理论值基本吻合，表明电位滴定法可准确反映供试品溶液中酸的含量。精密量取生脉注射液2 ml，加于预先处理好的001*1型强酸性阳离子交换树脂柱（树脂约10 ml），加水90 ml洗脱，收集流出液和洗脱液置入100 ml量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。精密量取供试品溶液25 ml置入100 ml滴定杯，加水10 ml，置于自动电位仪上，用氢氧化钠滴定液滴定（电极DG 111-SC），同法测定空白溶液。以ΔE/ΔV-V绘制一阶导数曲线，每1 ml 氢氧化钠滴定液（0.01004 mol/L）相当于0.6606 mg苹果酸，生脉注射液中的总有机酸含量以苹果酸计，结果见表1。

方法学考察：取同一批样品（批号：09122603）制得的供试品溶液，分别连续测定6次，消耗氢氧化钠滴定液的平均体积为6.8948 ml，RSD为0.3 %，表明方法精密度良好。取同一批次样品（批号：09122603），平行制备6份供试品溶液，依法测定，总酸含量平均值为9.1108 mg/ml，RSD为1.6 %，表明方法重复性良好。取同一供试品溶液（批号：09122603），分别于0，2，4，6，12 h测定，消耗氢氧化钠滴定液的平均体积为6.8954 ml，RSD为2.0 %，表明供试品溶液放置12 h，基本稳定。精密量取已知含量的本品（批号：09122603）1 ml，精密加入苹果酸对照品溶液（9.0248 mg/ml）1 ml，混匀，按供试品制备方法制得加样回收溶液，平行制备6份，依法测定，平均回收率为99.9%，RSD为1.4 %，表明方法准确。

2.2.5 总无机成分的含量测定精密量取生脉注射液2 ml，至炽灼至恒重的坩埚中，缓缓炽灼至完全炭化，放冷至室温，加硫酸0.5 ml使湿润，低温加热至硫酸蒸气除尽后，于600 ℃炽灼使完全灰化，移至干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再于600 ℃炽灼至恒重，即得，结果见表1。

表1 生脉注射液大类成分含量/mg·ml-1（n=2）

3 讨论

本研究以冷冻-减压干燥法测定总固体含量，采用比色法、电位滴定法、炽灼残渣法等方法测定总糖、总皂苷、总木脂素、总酸、总无机成分等大类成分的含量。结果表明，3个厂家的7批生脉注射液总固体、总糖、总皂苷、总木脂素、总酸、总无机成分含量分别在37.7～78.1，25.87～56.90，1.33～1.97，0.07～0.24，1.71～9.11，1.62～8.62 mg/ml之间；不同批次样品的总皂苷、总木脂素含量波动范围较小，总固体、总糖、总酸、总无机成分含量差异较大。7批样品总糖、总皂苷、总木脂素、总酸、总无机成分占总固体百分比分别在55.2 %～74.1 %，2.2 %～3.8 %，0.2 %～0.5 %，3.7 %～11.7 %，3.1 %～11.0 %之间，占比最高的是总糖，其次为总有机酸和总无机成分，再次为总皂苷，占比最低的为总木脂素，各大类成分含量总和均占总固体含量80 %以上（见图1），达到了《中药、天然药物注射剂基本技术要求》（国食药监注[2007]743号）的规定，在一定程度上明确了生脉注射液的物质组成和相对比例，在此基础上进一步开展的单个化学成分的含量测定将另文报道。