UPLC-FLR测定长效人红细胞生长刺激素中唾液酸含量

吕素娟，刘作龙，王玉营，王惠琰，王云飞

（山东丰金生物医药有限公司，山东 烟台 264000）

Darbepoetin alfa（商品名 Aranesp）是Amgen公司于2001年上市的多糖基化位点修饰的长效人红细胞生长刺激素，用于治疗慢性肾功能衰竭、癌症放疗化疗及骨髓衰竭患者的贫血[1-3]，该产品于2021年于国内上市。本研究使用的苏州康聚生物科技有限公司研制的与Aranesp具有相同氨基酸序列的重组人新型红细胞生长刺激素（处于临床试验阶段），将促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）一级结构中的5个氨基酸进行定点突变，在57位和115位改变得到的2个天冬酰胺成为新的N-连接糖基化位点，N糖基化位点由3个增加到5个，从而使其体内半衰期比EPO延长了3倍[4]。因为其糖基化的高丰度和不均一性会影响体内活性[5-7]，不均一性主要由糖链末端唾液酸引起，常见的唾液酸主要有两种：N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）和N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）。人类缺乏胞苷酸N-乙酰神经氨酸羟化酶基，因此不能合成Neu5Gc，但大多数哺乳动物细胞能进行Neu5Gc修饰，而外源性Neu5Gc及其复合物被机体吸收并沉积在细胞表面，诱导体内产生抗Neu5Gc抗体，进而诱导机体产生慢性炎症最终导致肿瘤的发生和发展[8-9]。因此，唾液酸化（主要为Neu5Ac）程度的高低直接影响药物体内半衰期和药物安全性，是重要的质控指标[4,10-11]。

《中国药典》2020年版三部中人促红素唾液酸含量测定为通则3102，使用酸水解后的唾液酸与间苯二酚反应生成有色化合物，使用有机酸萃取后，测定含量。该方法操作过程使用较多有机溶剂，对环境及人员健康影响较大，且步骤繁琐，结果重现性、耐用性较差，只能测定总唾液酸值，不能区分唾液酸种类[12]。本研究中长效人红细胞生长刺激素与柱前荧光衍生试剂4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺盐酸盐（DMB）[13-15]，在酸性条件下生成DMB衍生物，该衍生物经373 nm激发光激发后，在448 nm能产生可辨识可定量的较强荧光信号，从而对样品中Neu5AC和Neu5Gc进行定性和定量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪-FLR荧光检测器（Waters）；XPR105十万分之一电子天平（梅特勒-托利多）；UV2700紫外可见分光光度计（岛津）；ThermoMixer C恒温混匀仪（Eppendorf）；色谱柱Acclaim RSLC 120 C18（2.2 μm，2.1 mm ×100 mm）（Thermo）。

1.2 试药

N-乙酰神经氨酸（色谱纯，TCI）；N-羟乙酰神经氨酸（色谱纯，TCI）；甲醇（色谱纯，Fisher Chemical）；乙腈（色谱纯，Fisher Chemical）；冰乙酸（Sigma）；2-巯基乙醇（Sigma）；连二亚硫酸钠（Sigma）；4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺盐酸盐（DMB，Sigma）；实验用水为Milli Q超纯水；长效人红细胞生长刺激素原液（山东丰金生物医药有限公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 DMB标记衍生试剂 取15 ml离心管，加入1.5 ml超纯水、172 μl冰乙酸、112 μl 2-巯基乙醇，涡旋混匀；然后加入4.9 mg连二亚硫酸钠（配制前称于称量纸中），涡旋溶解（此时溶液可能变浑浊）；最后加入3.5 mg DMB试剂（配制前称于称量纸中）和200 μl超纯水，涡旋混匀，现用现配。

2.1.2 Neu5Ac标准液（STD）（10 mmol/L） 准确称取Neu5Ac干粉15.5 mg置入5 ml量瓶，超纯水溶解并定容，配制成10 mmol/L Neu5Ac STD。

2.1.3 Neu5Gc标准液（STD）（10 mmol/L） 准确称取Neu5Gc干粉16.3 mg置入5 ml量瓶，超纯水溶解并定容，配制成10 mmol/L Neu5Gc STD。取20 μl Neu5Gc STD（10 mmol/L）逐级稀释至0.1 mmol/L Neu5Gc STD，终体积500 μl 以上。

2.1.4 唾液酸混合标准液：各取100 μl Neu5Ac STD（10 mmol/L）和100 μl Neu5Gc STD（0.1 mmol/L），加800 μl超纯水，涡旋混匀后，再将混合溶液稀释5倍，取200 μl，加800 μl超纯水，涡旋混匀，为标准溶液（200 pmol/μl Neu5Ac STD和2 pmol/μl Neu5Gc STD），现用现配。

2.1.5 标准曲线按照表1稀释。

表1 标准曲线稀释表

2.2 样品前处理

2.2.1 样品水解 将长效人红细胞生长刺激素原液稀释至0.1 mg/ml，取50 μl稀释至0.1 mg/ml的待测样品置入1.5 ml离心管，加入50 μl 4 mol/L乙酸溶液，混合均匀后置于恒温混匀仪中，80 ℃保温2.5 h。

2.2.2 样品和标准品标记衍生 在100 μl水解后的样品和100 μl标准品溶液中加入100 μl DMB标记试剂，混匀后置于恒温混匀仪中，50 ℃保温3 h。

2.2.3 中止 在通风橱中移取50 μl标记完成的样品及标准品分别加至装有950 μl超纯水的2 ml离心管中，混匀后，用于色谱分析。

2.3 色谱条件

流速0.45 ml/min；压力上限10000 psi；柱温45 ℃；样品室温度6 ℃；荧光检测器激发波长373 nm、发射波长448 nm；进样体积10 μl；运行时间13 min；流动相（甲醇:乙腈:超纯水=7:9:84）。用流动相平衡超高效液相色谱仪，以流动相为空白，重复进样3次至基线平稳，标准品及样品进样10 μl，运行时间13 min，记录色谱图。

以水解体系中唾液酸标准品的浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算样品（0.05 mg/ml）水解体系中的唾液酸浓度（pmol/μl）。

2.4 方法验证

2.4.1 专属性 分别使用2.1.2和2.1.3项唾液酸标准液配制60 pmol/μl Neu5Ac STD、0.6 pmol/μl Neu5Gc STD，各取50 μl，同时使用超纯水、STD3（混合标准液）各50 μl，经2.2项处理后进样，色谱图见图1，可见超纯水及空白在Neu5Ac和Neu5Gc峰处无干扰峰，单Neu5Ac STD及单Neu5Gc STD各主峰出峰与STD3混合标准工作液出峰时间相同，证明该方法具有专属性。

图1 唾液酸专属性色谱图

2.4.2 线性与范围 以唾液酸峰面积为纵坐标，唾液酸标准品的浓度为横坐标，得到Neu5Ac标准曲线方程为：y=2.53×106x+2.96×106，r2=0.9989，表明标准品浓度范围20～100 pmol/μl内，线性关系良好；Neu5Gc标准曲线方程为：y=2.52×106x+1.32×104，r2=0.9991，表明标准品浓度范围0.2～1.0 pmol/μl内，线性关系良好。Neu5Ac和Neu5Gc标准溶液的色谱图见图2。

图2 唾液酸标准曲线色谱图

2.4.3 准确度 取长效人红细胞生长刺激素原液分别与STD5（2:8，高）混合，与STD3（5:5，中）混合，与STD1（2:8，低）混合，按步骤处理，各制备3份，每份检测3次，考察回收率，Neu5Ac回收率为89.6 %～95.1 %，RSD为2.5 %，见表2。Neu5Gc回收率为90.9 %～97.4 %，RSD为2.9 %，见表3，表明本法准确度较好。

表2 Neu5Ac回收率试验结果

表3 Neu5Gc回收率试验结果

2.4.4 重复性 使用1批长效人红细胞生长刺激素原液制备6份样品，重复测定6次，Neu5Ac含量RSD为0.3 %，Neu5Gc含量RSD为0.1 %，证明该方法的重复性较好，见表4。

表4 唾液酸重复性试验结果

2.4.5 溶液稳定性 将进行重复性检测的长效人红细胞生长刺激素原液存放12 h后，再次进行检测，计算测定结果相对首次检测结果的回收率，Neu5Ac含量回收率范围为99.0 %～100 %，回收率RSD为0.1 %，Neu5Gc含量回收率范围为97.0 %～100 %，回收率RSD为0.8 %，证明该方法样品溶液稳定性较好，见表5。

表5 唾液酸稳定性试验结果

2.5 长效人红细胞生长刺激素原液唾液酸含量的测定

取5批长效人红细胞生长刺激素原液，按要求进行样品处理，使用DMB衍生进行唾液酸含量检测，结果见表6，各批次满足质量标准每1 mol蛋白唾液酸含量应不低于18.0 mol，并在理论最大唾液酸修饰含量22.0 mol范围内。

表6 长效人红细胞生长刺激素原液唾液酸含量测定结果

3 讨论

本研究将长效人红细胞生长刺激素原液酸水解后，使用DMB试剂衍生，然后使用超高效液相色谱-荧光检测器进行唾液酸Neu5Ac和Neu5Gc含量检测，该方法使用外标法定量，经过专属性、重复性、准确度、线性与范围、溶液稳定性验证，证明该方法具有较强的实用性，相比于中国药典间苯二酚法，规避了繁琐的样品前处理以及有机溶剂的危害，并能够区分唾液酸Neu5Ac和Neu5Gc两种类型修饰，可用于长效人红细胞生长刺激素原液唾液酸含量的分析。