母亲胱硫醚β-合酶基因多态性与子代先心病及亚型的关联研究*

中南大学湘雅公共卫生学院流行病与卫生统计学系(410078)

刘亦萍 杨土保 王婷婷 张森茂 陈乐陶 罗 柳 刁静怡 李金琦 李依寰 孙梦婷 宋欣俐 魏剑晖 舒 靖 秦家碧△

【提 要】 目的 探讨母亲胱硫醚β-合成酶(cystathionine β synthase，CBS)基因多态性与子代先心病(congenital heart disease，CHD)及其亚型的关联，为CHD遗传易感标志物的研究提供流行病学依据。方法 以464例单纯CHD患儿母亲为病例组，504例正常儿童母亲为对照组，开展病例对照研究。通过问卷调查，收集研究对象的基本信息。完成调查问卷后，采集5ml血液，用于CBS基因多态性的检测。利用多因素logistic回归模型评估CBS基因多态性与CHD及亚型的关联；利用Haploview 4.2软件的四配子法构建单倍型，评估单倍型与CHD的关联；利用广义多因子降维法(GMDR)分析基因-基因交互作用与CHD的关联。结果 多因素logistic回归分析结果显示，母亲CBS基因位点rs2851391和rs234714的多态性与子代CHD及其两种亚型(ASD和PDA)的发病存在关联；且经FDR调整后，关联仍然具有统计学意义(QFDR<0.05)。5个SNP位点均与VSD的发生无关(QFDR>0.05)。GMDR分析结果显示，5个SNP位点的基因-基因交互作用模型与子代CHD的发生无关(P>0.05)。rs1051319和rs2851391位点构成的单倍型G-T可能与子代CHD的发生有关(QFDR<0.05)。结论 母亲CBS基因多态性与子代CHD、ASD和PDA的发生有关，CBS基因位点构成的单倍型(G-T)也与子代CHD的发生有关。

先天性心脏病(congenital heart disease，CHD)是我国最常见的出生缺陷[1]，其发生与遗传和环境因素密切相关[2]。流行病学研究表明，围孕期增补叶酸可有效降低胎儿CHD的风险[3]，但这种风险降低的潜在机制尚不清楚。关注叶酸/同型半胱氨酸(Hcy)代谢相关基因与CHD的关联，可帮助解释一部分机制。胱硫醚β-合成酶(cystathionine β synthase，CBS)是体内Hcy转硫途径的关键酶之一，其活性受CBS基因调控。该基因变异可导致CBS活性降低，造成高同型半胱氨酸血症(HHcy)，从而影响胚胎心脏发育[4-7]。因此，CBS基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)可能与CHD的发生有关。既往关于该主题的研究主要集中在少数几个SNPs上，且研究结果不一致[8-11]。本研究评估母亲CBS基因多个SNPs与CHD及其亚型包括室间隔缺损(VSD)、房间隔缺损(ASD)、动脉导管未闭(PDA)的关系，为CHD遗传易感标志物的研究提供流行病学依据。

资料与方法

1.研究对象

选取2018年3月至2019年8月湖南省儿童医院心胸外科所收治的464例0～1岁单纯CHD患儿的母亲为病例组。464例患儿CHD各类型的百分比分别为：ASD 78例(16.8%)，VSD 286例(61.6%)，房室间隔缺损50例(10.8%)，PDA 130例(28.0%)，主肺动脉隔缺损6例(1.3%)，法洛四联症26例(5.6%)，完全大动脉转位2例(0.4%)。对照组为同一时期在湖南省儿童医院就诊的0～1岁正常儿童母亲。

2.问卷调查

本研究使用统一的调查问卷，由经培训过的调查员对研究对象进行面访调查。调查内容包括：母亲文化程度、怀孕时年龄、死胎或死产史、自然流产史、早产史、妊娠糖尿病史、妊娠高血压史、家族三代近亲婚配史、家族成员先天畸形史、孕前感冒、孕前吸烟、孕前暴露在二手烟环境、孕前饮酒、孕前有饮茶习惯、长期居住地附近有可疑环境污染源、染发或烫发、怀孕前或孕期服用叶酸和饲养或亲密接触宠物等。

3.DNA提取和基因型检测

完成调查问卷后，取研究对象3～5ml外周静脉血，使用QIAamp DNA Mini kit按照标准规程提取DNA，用于基因分型。参考相关文献介绍的方法[12]，筛选基因的待检位点。具体为：检索NCBI数据库，寻找CBS基因的主要SNP位点，并结合HapMap数据库核实SNP位点信息，要求各位点最小等位基因频率(MAF)≥10%。最终选择了9个基因位点(rs12613、rs234783、rs234784、rs2851391、rs2298759、rs234785、rs234713、rs234714、rs1051319)作为本研究的待检基因位点。利用Massarray飞行时间质谱进行SNP检测，具体检测工作由博淼生物科技(北京)有限公司完成。

4.统计分析

利用Epidata3.0软件建立数据库，应用SPSS 24.0软件进行数据处理及统计分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。涉及多重比较时，采用错误发现率(FDR)校正的方法调整P值以控制假阳性率，得到校正P值(QFDR)，并以QFDR<0.05为差异具有统计学意义[13]。计数资料采用率或构成比进行描述，比较采用χ2检验或者Fisher精确概率法；等级资料采用Wilcoxon秩和检验。运用χ2检验进行对照组SNP位点的Hardy-Weinberg遗传平衡检验。采用logistic回归计算所有的比值比(OR)和95%置信区间(CIs)，多因素logistic回归计算调整混杂因素后的OR和95%CIs。分析在三种遗传模型下，SNP位点与CHD的关系，三种遗传模型包括隐性模型(纯合突变型 vs 野生型+杂合型)、显性模型(纯合突变型+杂合型 vs 野生型)和加性模型(纯合突变型 vs 杂合型 vs 野生型)。利用Haploview 4.2软件计算不同SNP位点之间的r2值，r2<0.8表明SNP位点之间不存在连锁不平衡；同时，利用四配子检验的方法构建单倍型块，并分析各单倍型在病例组和对照组之间的分布。基于广义多因子降维法(GMDR)进行基因-基因交互作用分析，在模型有统计学意义的情况下，测试样本的准确度越大、交叉验证一致性(CVC)越接近10，模型越好。

结 果

1.两组基线资料的比较

病例组和对照组基线资料的比较结果见表1，在后续多因素分析中，将对两组间比较有差异的变量(P<0.05)进行调整。

表1 基线资料比较

2.对照组基因Hardy-Weinberg平衡检验

CBS基因型分布频率以及对照组人群中SNP位点的Hardy-Weinberg平衡检验结果如表2所示。仅rs234784位点不符合Hardy-Weinberg平衡规律(P<0.05)。此外，rs2298759、rs12613和rs234713三个位点在研究人群中MAF<0.05，也不参与后续分析。

表2 母亲CBS基因型分布频率及对照组Hardy-Weinberg平衡检验

3.母亲CBS基因多态性与子代CHD的关联分析

多因素logistic回归分析及FDR调整P值的结果如表3所示，在隐性遗传模型下，rs2851391位点和rs234714位点与子代CHD及ASD的关联具有统计学意义(QFDR<0.05)；rs2851391位点与子代PDA的关联具有统计学意义(QFDR<0.05)。在加性遗传模型下，rs2851391位点和rs234714位点与子代PDA的关联具有统计学意义(QFDR<0.05)。rs2851391位点和rs234714位点的纯合突变型TT增加了子代CHD、ASD以及PDA的发病风险。

表3 母亲CBS基因多态性与子代CHD的关联

4.连锁不平衡及单倍型分析

连锁不平衡分析显示，各位点间不存在连锁不平衡。单倍型分析显示，5个SNP共形成了1个单倍型块(block)(图1)，单倍型在两组间的分布情况如表4所示。Block1内包含2个位点：rs1051319与rs2851391，构成3种单倍型：G-C、G-T、C-C；其中，G-T(χ2=8.653，QFDR=0.004)，单倍型的频率分布在两个组间差异具有统计学意义。

图1 各位点LD图

表4 SNP位点形成的单倍型在病例组和对照组中的分布情况

5.基因-基因交互作用分析

结果显示，基因-基因交互作用模型均无统计学意义(P>0.05)，提示5个SNP位点的基因-基因交互作用模型可能与子代CHD的发生无关(表5)。

表5 基因-基因的交互作用

讨 论

本研究评估了母亲CBS基因多态性与子代CHD的关联，多因素logistic回归分析显示，母亲CBS基因位点rs2851391和rs234714的纯合突变型TT增加了子代CHD发病风险。经FDR调整P值后，两个位点与子代CHD的关联仍具有统计学意义。有研究发现，rs2851391位点的基因多态性降低了CBS的活性[14]，且该位点TT基因型的受试者血浆Hcy水平明显高于TC和CC基因型[15]。Hcy的增多，对胚胎的发育有毒性作用，可以氧化巯基产生自由基，干扰早期心血管生长发育[16]；HHcy会产生大量S-腺苷蛋氨酸，影响DNA的甲基化程度，有研究表明在胚胎形成过程中异常的DNA甲基化可能是先天缺陷的致病因素[17]。

占先心病前3位的亚型分别是：VSD、ASD、PDA[18-19]，与本研究的CHD亚型构成比一致，所以对母亲CBS基因多态性与子代CHD三种亚型的关联进行了评估。多因素logistic回归分析结果显示，CBS基因两个位点rs2851391和rs234714的纯合突变型TT增加了子代ASD、PDA的发病风险。且经FDR调整P值后，两个位点与ASD、PDA的关联仍具有统计学意义。总的来说，rs2851391和rs234714的纯合突变型TT是CHD、ASD以及PDA发病的危险因素，暂未发现与VSD发病有关。研究结果提示，不同CHD亚型遗传易感因素可能存在差别，但具体机制还有待进一步的研究。

在单个基因位点多态性分析的基础上，为了增加遗传统计效力，对5个SNP位点进行了单倍型的构建，形成了一个包含rs1051319和rs2851391的单倍型块。其中G-T单倍型可能与子代CHD的发生有关(QFDR<0.05)，是子代CHD发病的危险因素(OR=1.366)。

叶酸/Hcy的代谢非常复杂，胚胎细胞中的叶酸/Hcy水平可能受基因-基因交互作用影响。因此，本研究进一步分析不同位点间的交互作用。结果显示，5个SNP的基因-基因交互作用模型可能与子代CHD的发生无关(P>0.05)。

研究的局限性：第一，本研究是基于医院的病例对照研究，只选择了一所医院，可能影响研究对象的代表性，存在一定的选择偏倚。第二，尽管在分析母亲CBS基因多态性与子代CHD及亚型的关系时调整了许多混杂因素，但仍不能完全排除潜在的残留混杂。第三，由于样本量的限制，ASD、VSD和PDA以外的CHD亚型与基因多态性的关联没有进一步研究。

综上所述，母亲CBS基因多态性与子代CHD、ASD和PDA的发生有关，CBS基因位点构成的单倍型(G-T)也与子代CHD的发生有关。