肺炎患儿miR-147a、miR-217的表达及其与肺功能、炎症因子的相关性

矫 岩，李 丹，刘文东，韩文超

(青岛市市立医院儿科，山东 青岛 266000)

肺炎是全世界儿童死亡的第二大原因。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)提出出现临床体征和症状(包括咳嗽、发烧、进食不良、发绀、呼噜声、鼻腔扩张、呼吸急促及下胸壁内陷)合并放射学结果进行肺炎诊断[1]，但病例个体差异及检测手段不同往往会影响肺炎的诊断，而且约9%肺炎儿童易出现复发。因此，及时发现并积极治疗对提高患者生活质量意义重大。靶向筛查及治疗近年来应用广泛，微小RNA(microRNA，miRNA)是小非编码单链RNA，约22～24个核苷酸组成，在基因表达的转录后调节机制中发挥关键作用，miRNA表达失调影响细胞活动和疾病进展[2]。Huang等[3]提出，在肺炎发病机制中存在miRNA表达失调。炎症因子可激活疾病过程中炎症反应，一定程度反映肺炎严重程度及免疫反应进程[4]，因此，本项目主要研究血清中miR-147a和miR-217表达变化与炎症指标及肺功能指标的相关性，旨在寻找儿童肺炎无创性生物标志物，改善肺炎诊断及治疗效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年1月至2021年12月于青岛市市立医院接受治疗的100例肺炎患儿为研究对象(肺炎组)。纳入标准：①本研究要求肺炎病原体为肺炎支原体，符合《儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识(2015年版)》诊断标准；②无其他肺部相关炎症疾病；③无哮喘、心肌相关炎症等疾病；④未接受过其他卫生单位治疗及无自行用药；⑤患者家属沟通顺畅，并签署知情同意书。排除标准：①伴有其他呼吸道感染疾病；②存在免疫缺陷问题；③临床资料不全。肺炎组年龄1～9岁，平均年龄(5.33±1.37)岁，男54例，女46例。并选取同一时期来院做健康体检的41例儿童作为对照组，年龄1～10岁，平均年龄(6.21±1.29)岁，男21例，女20例。本研究经我院伦理委员会审查通过。

1.2 研究方法

1.2.1静脉血检测

所有研究对象均抽取空腹静脉血5 mL，以3 000 r/min离心10 min后将血清取出置于-80℃保存待用。利用RNA提取试剂盒(Invitrogen，货号为10296010)提取总RNA，再按照逆转录试剂盒(Invitrogen，货号为4368813)操作说明制备cDNA，以U6为内参，RT-PCR分析miR-147a和miR-217相对表达水平，引物序列：miR-147a正向引物为ATTGGCAAGATGTTCCTTGC，反向引物为GTGTGTGGAAATGCTTCTGC；miR-217正向引物为GCCGTACTGCATCAGGAAC，反向引物为GCAGGGTCCGAGGTATTC；U6正向引物为TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC，反向引物为GTGCAGGGTCCGAGGT。通过2-△△Ct法进行相对表达水平的量化分析。

1.2.2肺功能检测

采用COSMEDPFT4型肺功能仪检测肺功能指标，主要包括呼气流量(peak expiratory flow，PEF)，第一秒用力呼气容积(force expiratory volume in the first second，FEV1)，用力肺活量(force vital capacity，FVC)及FEV1/FVC，25%、50%、75%肺活量的呼气流速V25、V50、V75。

1.2.3炎症因子检测

采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清中白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-1β和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)含量，具体操作按照ELISA试剂盒要求进行。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 血清miR-147a和miR-217表达水平比较

肺炎组血清miR-147a、miR-217表达量均低于对照组，差异有统计学意义(t值分别为4.302、5.322，P<0.05)，见表1。

表1 两组儿童血清miR-147a和miR-217表达水平比较

2.2 两组儿童肺功能比较

肺炎组儿童PEF、FEV1、FEV1/FVC、V25、V50、V75水平均低于对照组，差异有统计学意义(t值分别为5.921、6.035、8.392、5.772、7.274、9.926，P<0.05)，见表2。

表2 两组儿童肺功能比较

2.3 两组儿童血清炎症因子水平比较

肺炎组IL-6、IL-1β、TNF-α水平均高于对照组，差异有统计学意义(t值分别为28.372、9.372、11.285，P<0.05)，见表3。

表3 两组儿童血清炎症因子表达水平比较

2.4 肺炎组儿童血清miR-147a、miR-217表达水平与肺功能和炎症因子相关性分析

miR-147a、miR-217与肺功能指标(PEF、FEV1、FEV1/FVC、V25、V50、V75)呈正相关(r值介于0.654～0.772之间，P<0.05)，与炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)呈负相关(r值介于-0.811～-0.784之间，P<0.05)，差异均有统计学意义，见表4。

表4 肺炎组儿童血清miR-147a、miR-217表达水平与肺功能和炎症因子相关性分析

3 讨论

肺炎是急性下呼吸道感染最严重的表现之一，是5岁以下儿童死亡的主要原因[5]。当病原微生物侵入宿主时，可刺激免疫系统产生炎症因子，并在局部积聚，进而引起呼吸道感染，临床表现为支气管炎、肺炎等[6]。感染早期出现明显发烧、咳嗽、有痰、呼吸困难等症状，同时身体释放炎症因子、有毒代谢产物，导致细胞损伤，进一步引发免疫功能紊乱[7]。儿童免疫系统发育尚未完善，因此肺炎感染血清中miRNA表达与肺功能及炎症因子释放的相关性尚不清楚，需要深入探讨。

3.1 肺炎患儿miR-147a和miR-127表达下调

miRNA是由基因组非编码区产生的内源性单链小分子RNA，研究发现miRNA表达异常与多种疾病发生和发展密切相关。Chu等[8]研究提出，对比肺炎和正常儿童外周血miRNA表达谱发现，存在26个显著上调miRNAs和7个显著下调miRNA。miRNA参与肺炎病理过程，并参与肺炎免疫应答过程。Liu等[9]在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导小鼠肺炎的动物模型中发现，miR-147a表达显著下调，并靶向作用于核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)激活蛋白，进而调节LPS诱导的肺部炎症和损伤，miR-147a表达下调与小鼠IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α升高有关。miR-147a低表达参与汞诱导的人系膜细胞增殖、纤维化和氧化应激，促进糖尿病肾病恶性进展[10]。另外，诸多学者发现miR-147a在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞增殖、迁移、侵袭中发挥抑制作用，过表达miR-147a可抑制NSCLC进展[11-12]。Chen等[13]提出miR-217可作为新的诊断肺炎的生物标志物，在LPS诱导小鼠重症肺炎模型中，发现LPS处理可降低miR-127表达水平，过表达miR-127后可降低LPS诱导的细胞炎症因子表达，并通过靶向抑制AKT和NF-KB信号通路，进一步减轻重症肺炎。Xie等[14]报道miR-127可能通过靶向作用于免疫球蛋白受体减轻肺部炎症，此外在支气管肺泡灌洗液中发现miR-127表达下调，这种异常表达可作为疾病诊断的生物标志物[15]。综上，本研究将miR-147a和miR-127作为肺炎新兴生物标志物探讨其与肺炎儿童肺功能和炎症因子表达相关性，分析miR-147a和miR-127在儿童肺炎的临床价值。

3.2 肺炎患儿miR-147a、miR-127表达与肺功能指标呈正相关，与炎症因子水平呈负相关

本研究结果表明，肺炎组儿童血清中miR-147a和miR-127表达显著低于对照组，相关性分析结果表明，miR-147a和miR-127与肺功能指标呈正相关，与细胞炎症指标呈负相关，且差异有统计学意义。上述结果提示miR-147a、miR-127与肺炎进展密切相关，可能一方面为miR-147a、miR-127与抗炎因子靶基因结合，另一方面肺炎进展诱导miR-147a和miR-127表达下调，进而促进释放炎症因子。Khadzhieva等[16]分析肺炎和肺功能之间的共享基因位点，经基因富集分析发现，肺炎和肺功能基因集与炎症相关特征基因之间存在显著重叠。肺炎与细胞炎症有关，TNF-α是单核细胞和巨噬细胞产生的一种主要细胞因子，是一种重要的炎症介质[17]。TNF-α通过诱导局部浸润、中性粒细胞趋化、吞噬和杀死病原体来启动炎症反应[18]。IL-6和IL-1β是单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞产生的一种重要细胞因子，是炎症反应急性期的关键介质[19]。本研究提示肺炎儿童患者miR-147a和miR-127表达下调与炎症水平上升有关，与上述研究结果一致。这充分说明血清miR-147a和miR-127表达水平介导肺炎发生、发展的主要基质可能与调节肺功能基因及炎症因子密切相关。本研究不足之处在于临床样本收集有限，miR-147a和miR-127参与肺炎进展具体分子机制还需深入探讨，后期研究将扩大样本并结合基础研究开展，为儿童肺炎诊疗提供可靠生物靶点。

综上所述，本研究发现儿童肺炎血清中miR-147a和miR-127表达下调，且与肺功能指标呈正相关，与炎症因子呈负相关，初步探明miR-147a和miR-127可能是潜在的肺炎诊疗靶点。