鱼腥草黄酮类化合物提取、纯化及抗氧化研究

鱼腥草又名折耳根，学名为蕺菜，主要分布于中国、韩国、日本和东南亚等地区，资源非常丰富，是一种药食同源的食物，常作为食材或者药材应用，在西南地区被人们广泛食用。例如，鱼腥草是西南地区的首席凉拌菜，还可以用作炒菜的原材料，深受人们喜爱[1]。同时，在中医治疗方面，可以将鱼腥草晒干煮水喝或泡茶喝，具有清热解毒、祛痰止咳、镇痛止血等功效，用于治疗肺炎、支气管炎和慢性阻塞性呼吸道疾病[2]。根据目前研究，鱼腥草中含有丰富的活性成分，如挥发油、黄酮类化合物和有机酸等，其中黄酮类化合物最为丰富[3]。研究表明，黄酮类化合物具有较好的生物活性，如抗氧化、抗癌、抗肿瘤、降血压和预防心血管疾病等功能活性[4]。因此，研究鱼腥草黄酮的提取及抗氧化活性研究具有重要的实际意义。

目前，有关鱼腥草的研究大多集中于黄酮的提取，提取方法有溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取及双水相提取法等，而对于鱼腥草黄酮的纯化及抗氧化活性研究较少[1]。其中，超声波辅助提取法主要是利用超声波在介质中的机械振动及空化作用，提高黄酮的溶出效率[5]。一般，黄酮类化合物的抗氧化性主要体现在供氢能力，其结构中的羟基和羰基可通过阻止自由基产生来发挥抗氧化作用。因此，本研究采用超声波辅助法提取鱼腥草中的黄酮，通过正交试验优化黄酮的提取条件，利用大孔树脂D101对提取的黄酮进行粗纯化，并对比纯化前后的抗氧化活性，旨在为开发鱼腥草资源利用及新型保健食品、化妆用品、药品提供一定的理论科学依据，具有重要的社会效益和现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

鱼腥草干制品，经60 °C烘干，磨碎，过60目筛备用；芦丁，维克生物科技有限公司；D101大孔树脂，东鸿化工有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）与2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS），合肥巴斯夫科技有限公司；乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠和过硫酸钾（均为分析纯），国药集团化学试剂有限公司；试验用水为去离子水（实验室自制）。

WF-18超微粉碎机，温州顶历医疗器械有限公司；KS-600D超声波仪器，宁波海曙科生超声设备有限公司；TDL-40B离心机，上海安亭科学仪器厂；FA2104B电子天平，上海市安亭电子仪器厂；V-1000分光光度计，翱艺仪器有限公司；THZ-100恒温振荡培养箱，上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定吸光度[6]。分别精密吸取芦丁对照液（0.2 mg·mL-1） 0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL和10.0 mL，分别放入50 mL的容量瓶中，加5% NaNO2溶液0.3 mL，充分摇晃后等待反应6 min，滴加0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液进行摇晃后，等待反应6 min，加4.00 mL 4% NaOH溶液反应10 min，最后用70%乙醇定容，设空白对照，于510 nm处测吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线y=0.010 8x+0.013 7，R2=0.999 7。

1.2.2 超声波辅助提取鱼腥草黄酮

准确称取一定量的鱼腥草粉末样品，加入一定比例的乙醇溶液，然后利用超声波提取一定时间，将提取液离心（4 000 r·min-1，10 min）后定容，作为待测液。

1.2.3 单因素试验

（1）乙醇浓度对鱼腥草黄酮提取率的影响。在料液比1∶20，超声时间60 min的条件下，研究乙醇浓度为30%、40%、50%、60%和70%对鱼腥草黄酮提取率的影响。

（2）料液比（m∶V）对鱼腥草黄酮提取率的影响。在乙醇浓度50%，超声时间60 min条件下，研究不同料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50对鱼腥草黄酮提取率的影响。

（3）提取时间对鱼腥草黄酮提取率的影响。在料液比为1∶40，乙醇浓度50%的条件下，分别研究超声提取时间30 min、40 min、50 min、60 min和70 min对鱼腥草黄酮提取率的影响。

1.2.4 正交试验

在得出3个因素最优提取水平条件下，采用L9(34)正交试验设计对鱼腥草黄酮类化合物的提取工艺进行优化。

1.2.5 大孔树脂纯化

（1）树脂的预处理。树脂用无水乙醇浸泡24 h，用水清洗至无刺激性气味，在5% HCl溶液浸泡2 h后用水洗至中性，2% NaOH溶液浸泡2 h，水洗至中性备用。

（2）静态吸附解吸试验。在100 mL具塞磨口三角瓶中加入5 g处理活化后的树脂，加入50 mL鱼腥草粗提液，塞上磨口玻璃塞后在25 ℃条件下振荡吸附20 h，取吸附上清液测黄酮浓度，计算比吸附量（式1）。然后用水清洗吸附树脂表面杂质，以50%的乙醇为洗脱液，25 ℃条件下恒温振荡解吸20 h，取解吸上清液测黄酮浓度，计算解析率（式2）及纯度（式3）。

式中：C0为粗提液浓度，mg·mL-1；V0为粗提液体积，mL；C1为提纯后浓度，mg·mL-1；V1提纯后体积，mL；M为树脂质量，g。

式中：C2为洗脱液黄酮浓度，mg·mL-1；V2为洗脱液体积，mL；Q为比吸附量，mg·g-1；M为树脂质量，g。

纯度=冻干复溶液中黄酮的含量/复溶前冻干样

1.2.6 鱼腥草黄酮抗氧化活性的测定

（1）DPPH自由基清除率的测定。将纯化前后的鱼腥草黄酮样品稀释至不同的浓度，分别为0.500 00 mg·mL-1、0.250 00 mg·mL-1、0.125 00 mg·mL-1、0.062 50 mg·mL-1和0.031 25 mg·mL-1，同时设置样品空白组（不加提取液，利用提取溶剂代替）。按照JORAHOLMEN等[7]的方法测定DPPH自由基的清除能力。清除率计算公式为

式中：A0为无水乙醇与DPPH反应后的吸光值；A1为样液与DPPH反应后的吸光值；A2为样液与无水乙醇反应后的吸光值。

（2）ABTS自由基清除率的测定。样品处理同上，取0.2 mL提取液和2.0 mL ABTS+（7.4 mmol·L-1）反应液室温避光反应6 min。同时，设置空白对照组A0，在734 nm下测定其吸光值，用抗坏血酸进行阳性对照试验，具体详细操作同上。ABTS自由基清除率计算公式为

式中：A0为（0.2 mL）无水乙醇+（2 mL） ABTS溶液的吸光值；As为（0.2 mL）样品溶液+（2 mL）ABTS溶液的吸光值；Ac为（0.2 mL）样品溶液+（2 mL）无水乙醇的吸光值。

1.3 数据处理

试验均重复3次，数据以平均值±标准差表示，利用SPSS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对鱼腥草黄酮提取率的影响

由图1可知，鱼腥草黄酮提取率随乙醇浓度的增大呈先升高后降低的趋势。当乙醇浓度达到50%时，黄酮提取率最高。这是因为在一定乙醇浓度范围内，黄酮的溶出率逐渐提高，但当乙醇浓度超过50%时，鱼腥草中的其他脂溶性成分也会溶出，影响黄酮的提取，导致黄酮的提取率降低。因此，乙醇浓度选择50%。

图1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响图

2.1.2 料液比对鱼腥草黄酮提取率的影响

由图2可知，鱼腥草黄酮的提取率随提取液比例的增大逐渐提高，当料液比降低至1∶40以下时，黄酮提取率增加幅度较为减缓。这是因为在一定料液比范围内，随提取液比例的增大，物料与溶剂的接触面积增大，黄酮的溶出率增大，而当料液比降低至1∶40以下时，料液比对黄酮的溶出效率没有明显影响，而且过度增加溶剂添加量，会提高成本。综合考虑，选择料液比为1∶40。

图2 料液比对黄酮提取率的影响图

2.1.3 超声时间对鱼腥草总黄酮提取率的影响

由图3可知，在一定时间范围内，鱼腥草黄酮提取率随超声时间的延长逐渐升高，而当超声时间超过50 min后，鱼腥草黄酮的提取率显著降低。这是因为在一定时间内，随超声时间的延长，鱼腥草溶质分子运动加快，增大了黄酮的溶出速率，但当超声时间过长，会破坏鱼腥草黄酮的结构，导致提取率降低。因此，超声时间选择50 min。

图3 超声时间对黄酮提取率的影响图

2.2 正交试验

由表1可知，RB＞RA＞RC，即料液比是黄酮提取率最大的影响因素，其次是乙醇浓度与超声时间。同时，根据K值大小得到黄酮最佳提取工艺条件为A1B3C3组合，即乙醇浓度为40%、料液比为1∶50、超声时间为60 min，此时黄酮的提取率为4.764%。

表1 正交试验设计及结果表

2.3 黄酮的粗纯化

将鱼腥草黄酮粗提物在D101大孔树脂振荡吸附20 h后，测得吸附后黄酮浓度为2.606 mg·mL-1，经计算得出比吸附容量为5.27 mg·g-1，利用50%浓度乙醇水溶液对鱼腥草黄酮物质解吸，解吸率为94.87%。纯化前后提取液经过旋转蒸发除去乙醇冻干复溶后，最终测得黄酮的纯度提高了2.59倍。

2.4 纯化前后鱼腥草黄酮的体外抗氧化活性的测定

由图4可知，鱼腥草黄酮和维生素C对ABTS自由基的清除能力随其浓度的增大逐渐升高，当浓度升高至0.125 00 mg·mL-1后，对ABTS的清除能力趋于平缓。与未纯化黄酮相比，尤其在低黄酮浓度条件下，黄酮经纯化后对ABTS的清除率显著提高，当黄酮浓度为0.500 00 mg·mL-1时，未纯化黄酮对ABTS自由基的清除能力为94.54%，黄酮提纯后的清除能力高达97.93%，纯化后对ABTS自由基的清除能力显著提高，说明黄酮经纯化后其抗氧化活性提高。

图4 纯化前后鱼腥草黄酮对ABTS自由基清除能力的影响图

由图5可知，鱼腥草黄酮和维生素C对DPPH自由基的清除能力随其浓度的增大逐渐增强，而当浓度增大至0.125 00 mg·mL-1后，样品对DPPH的清除能力趋于平缓。维生素C的抗氧化能力显著高于鱼腥草黄酮。在浓度低于0.125 00 mg·mL-1时，与未纯化黄酮相比，纯化后的黄酮对DPPH自由基的清除能力显著提高，即低浓度下，黄酮纯度越高，其抗氧化活性越强。这是因为未纯化的黄酮提取液含有较多的杂质，与黄酮之间发生相互作用形成复合物，影响了黄酮提供氢的能力，导致抗氧化活性减弱，而纯化后的黄酮，纯度相对提高，可以增强黄酮对DPPH自由基的清除能力，说明纯化对黄酮类化合物的应用具有重要的意义。

图5 纯化前后鱼腥草黄酮对DPPH自由基清除能力的影响图

3 结论

本文主要通过超声波辅助法提取鱼腥草中的黄酮类化合物，对黄酮进行粗纯化，并通过DPPH和ABTS自由基的清除能力研究黄酮的抗氧化活性。研究表明鱼腥草黄酮的最佳提取条件为乙醇浓度40%、料液比1∶50、超声时间60 min，此时黄酮的提取率为4.764%。经D101型大孔树脂粗纯化后，纯度提高了2.59倍，经纯化处理后，黄酮的体外抗氧化活性显著提高，且与浓度呈一定的相关关系。该研究为鱼腥草的开发利用及功能食品的开发提供了理论基础。