云南大理地区奶牛内阿米巴原虫流行情况调查与分析

衡昭君，黄建新，王开胜，毛华明，杨建发1,*

(1.云南农业大学动物医学院，云南昆明 650201；2.大理农林职业学院，云南大理 671003；3.玉林师范学院生物与制药学院，广西玉林 537000；4.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201)

阿米巴原虫在自然界广泛分布，可通过粪-口途径、黏膜直接接触等多途径进行传播[1]。其中，寄生性的内阿米巴原虫是可感染人和动物的阿米巴原虫，可引起严重的人兽共患寄生虫病，虽然其主要病因是溶组织内阿米巴，但内阿米巴属的其他成员可以寄生于人和动物的肠道内，而且可能是致病性的[2]。动物可感染的内阿米巴原虫种类很多，包括溶组织内阿米巴(E.histolytica)、迪斯帕内阿米巴(E.dispar)、莫氏内阿米巴(E.moshkovskii)、波列基内阿米巴(E.polecki)、结肠内阿米巴(E.coli)和哈氏内阿米巴(E.hartmanni)等[3]。目前仅报道溶组织内阿米巴具有致病性，因此很少有人关注其他种属。Matsubayashi M等[4]研究指出，在人类或动物中E.polecki单一感染致病的可能性较小，但是与其他病原体混合感染可能加剧疾病严重程度，因此对于不同种类的内阿米巴原虫感染都应该引起重视。

目前对于阿米巴常见的实验室诊断方法有病原学诊断、免疫学诊断和PCR诊断[5]。自阿米巴原虫在我国被发现以来，关于内阿米巴原虫的研究重点集中在形态学观察、病原分离培养和鉴定，关于不同动物感染内阿米巴原虫的主要虫种及种类分布研究报道相对较少[6-7]。本试验针对内阿米巴原虫18S rRNA基因设计引物，对云南大理的宾川、洱源、巍山3个地区随机采集的奶牛粪样进行检测，以了解该地区的感染状况及奶牛感染内阿米巴原虫的主要虫种及种类分布，以期为该地区内阿米巴原虫感染的防治提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2019年10月至2019年12月从大理宾川、洱源和巍山地区共采集了113份奶牛粪便样品，其中宾川59份，洱源18份、巍山36份。将采集的样品送至云南农业大学寄生虫实验室，置于4℃冰箱，保存待用。

1.1.2 主要试剂 粪便DNA提取试剂盒，美国OMEGA公司产品；10×Taqbuffer(Mg2+free)、dNTPs Mixture、MgCl2、r-Taq酶、DNA Marker DL 2000、6×Loading buffer等，宝生物工程(大连)有限公司产品；GelStain核酸染料，北京全式金生物技术有限公司。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.3 主要仪器 高速台式离心机(Model CF-10)，Wise Spin公司产品；PCR仪(PTC-1148)，Bibby Scientific公司产品；瞬时迷你离心机(Min-6K)，长沙湘仪离心机仪器有限公司产品；电泳仪(BG-subMINI)、紫外分析仪(WGD-30)，BAYGENE公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取适量粪便于烧杯中，加自来水搅匀后用60目铜筛过滤至50 mL离心管中，平衡后3000 r/min离心3 min，弃上清，吸取250 μL沉淀，按照OMEGA公司生产的DNA提取试剂盒(型号：Stool DNA Kit 200) 的说明书提取样品的DNA。对提取的DNA置于-20℃保存备用。

1.2.2 内阿米巴原虫18S rRNA基因扩增 基于小核糖体核苷酸(18S rRNA)基因对样品进行内阿米巴原虫检测，参照Verweij J J等[8]设计的引物进行PCR扩增。具体引物序列及相关信息见表1。

表1 内阿米巴原虫18S rRNA PCR基因扩增引物Table 1 Table 1 PCR primers of 18 S rRNA gene Entamoeba

PCR反应体系：双蒸水15.875 μL，10×Taqbuffer(Mg2+free)2.5 μL，d NTPs Mixture 2.0 μL，MgCl21.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，r-Taq酶0.125 μL，模板DNA 1.0 μL。

PCR扩增条件：95℃(预变性)5 min；95℃(变性)0.5 min，57℃(退火)0.5 min，72℃(延伸)0.5 min，40次循环；72℃(变性)2 min；16℃结束反应。

PCR反应结束后，取5 μL PCR产物与1 μL 6×Loading buffer混匀后加入10 g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳，加入DNA Marker DL 2000 ，120 V电压30 min。在紫外凝胶成像设备中拍照，回收600 bp左右的扩增产物送往上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序。

1.2.3 测序与结果 在NCBI上分析内阿米巴原虫18S rRNA相关序列，使用MEGA7.0邻接法(Neighbor-joining method)构建系统发育进化树，自展值为1 000。

1.2.4 数据统计分析 按照不同地区及不同养殖方式划分计算感染率，使用SPSS 20.0统计软件对所得数据进行卡方检验(χ2)，计算P值，比较不同条件下大理奶牛的感染率是否存在差异。

2 结果

2.1 奶牛内阿米巴原虫感染情况

PCR检测结果显示，113份奶牛粪样中共从34份样品中成功扩增出条带大小约为600 bp的内阿米巴原虫 18S rRNA基因的目的片段，总阳性率为 30.09%(34/113)。部分阳性样品扩增结果见图1。

2.2 不同地区奶牛内阿米巴原虫的感染情况

通过对云南大理3个地区的113份奶牛新鲜粪便样品进行内阿米巴原虫的18S rRNA基因位点扩增，结果显示，本次调查的3个地区中均检测到内阿米巴感染(表2)，其中感染率最高的为宾川(32.20%)，洱源和巍山两地感染率一致，3个地区优势虫种皆为E.bovis，在宾川地区还检测出Entamoebasp.MG107/BEL感染。经卡方检验结果，这3个地区之间感染率差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 不同地区奶牛内阿米巴原虫的感染率及感染虫种Table 2 Infection rate and species of Entamoeba in dairy cows in different areas

M.DNA标准DL 2 000；1～4.样本；N.阴性对照；P.阳性对照。M.DNAMarker DL 2 000;1-4.Samples;N.Negative control;P.Positive control.图1 奶牛内阿米巴18S rRNA基因PCR产物Fig.1 PCR product of 18SrRNA gene of Entamoeba in cows

2.3 不同养殖方式奶牛内阿米巴原虫的感染情况

检测结果显示，散养的奶牛内阿米巴的感染率为25%(3/12)，规模化养殖的奶牛内阿米巴的感染率为30.69%(31/101)，不同养殖条件下感染率差异无统计学意义(P>0.05)，散养奶牛只有E.bovis的检出，规模化养殖还有Entamoebasp.MG107/BEL感染(表3)。

表3 不同养殖方式奶牛内阿米巴原虫的感染率及感染虫种Table 3 Infection rate and species of Entamoeba in dairy cows with different breeding styles

2.4 序列比对分析结果

通过对内阿米巴原虫18S rRNA基因位点进行扩增与测序，共从34份阳性样品中成功获得序列信息。其中分别有32份和2份样本的序列与GeneBank数据库中的E.bovis和Entamoebasp.MG107/BEL序列相似性均达到95%以上。选择3个地区代表性序列进行种系发育关系的构建，通过邻接法构建系统发育树显示，本研究中的序列BC12与E.bovis(MT734236)位于同一进化支上，EY27与Entamoebasp.(MZ752345)位于同一进化支上，WS53、EY27和BC12皆属于E.bovis，BC67与Entamoebasp.MG107/BEL(MT734612)位于同一进化支上，亲缘关系最近(图2)。

图2 云南省奶牛内阿米巴原虫18S rRNA基因种系发育关系Fig.2 Phylogenetic relationship of 18SrRNA gene of Entamoeba in dairy cows in Yunnan province

3 讨论

内阿米巴属原虫是可寄生于人和动物肠道及其他内脏器官的人兽共患原虫，属内种类较多[3]，广泛存在于水和土壤中，可携带许多病原体，起到病原体的贮存宿主和传播媒介的作用，严重危害人和动物的健康[9]。大理州年温差小，四季如春，适合肉牛和奶牛的生长繁衍[10]，但是大理的养殖业存在受内阿米巴原虫侵害的风险，因此，有必要对该地区的奶牛内阿米巴原虫的感染情况进行调查。

3.1 大理地区奶牛感染内阿米巴原虫情况分析

本研究结果发现，大理奶牛内阿米巴原虫的感染率为30.09%(34/113)。与国外有关牛内阿米巴原虫感染的研究报道相比，Nolan M J等[11]对乌干达国家公园牲畜内阿米巴原虫感染率的研究发现牛和山羊感染率分别为80.0%和60.0%；Masuda A[12]等发现日本和牛内阿米巴原虫总感染率为72%。与国内有关牛内阿米巴原虫调查结果相比，任玫[13]检测发现青海耗牛内阿米巴原虫的感染率36.32%；胡苏辉[14]在河北和天津地区检测的奶牛内阿米巴感染率为33.27%；赵霞等[15]在奶牛、黄牛和水牛中分别检测到的感染率为9.89%、7.12%和13.21%。本试验检测结果普遍比国外感染率低的原因可能是因为不同国家地理环境、采样季节、样品来源及养殖方式不同的影响，具体情况还需要进一步分析原因。本研究结果与国内报道的大部分结果一致，而与赵霞等[15]相差较大，据笔者调研可知，其原因可能是赵霞等人选择的是染色后镜检进行检查，而本试验选择的PCR方法，PCR方法精确度更高，灵敏度更好，结果更加准确，有更高的检出率。由此可见，国内外内阿米巴原虫的感染率普遍较高，可能是因为阿米巴原虫普遍存在环境中，不易去除，容易通过环境传播。

3.2 影响奶牛内阿米巴原虫感染差异分析

本研究采集了大理宾川、洱源和巍山3个地区粪样，结果发现宾川感染率最高(32.20%)，其余两地感染率一致(27.78%)。从地理位置上来看，宾川县位于大理州东部，洱源县位于大理州北部，巍山县位于在大理州南部，3个地区处于不同方位，宾川感染率高于洱源和巍山，洱源、巍山两地感染率一致，但总体来看3个地区感染率差异不明显，皆存在严重的内阿米巴原虫感染。大理地处云南西部，气候温暖，雨量充沛，四季如春，适合寄生虫繁殖和传播，但大理州内不同地点感染内阿米巴原虫是否存在明显差异，还需要进一步采集不同地点大量样品进行检测验证。

本试验结果分析显示，规模化养殖奶牛感染率(30.69%)略高于散养奶牛内阿米巴原虫感染率(25%)。内阿米巴原虫生活方式简单，包囊在脱离宿主后可以存活很长时间，且因为包囊对外界环境的抵抗力强，一般难以去除，因此，包囊可以长时间存在于环境中，污染养殖环境。散养奶牛较规模化养殖奶牛拥有更大的活动范围，因此它们之间彼此有相对较低的接触率，互相感染可能性就会降低，而规模化集中饲养易造成内阿米巴原虫的重复感染和交叉感染。但是统计学分析后发现两者差异不显著，说明云南大理奶牛内阿米巴原虫感染率较高。本次调查的奶牛除1头为犊牛外，其余均在1岁～3岁，因此年龄对内阿米巴原虫感染是否存在影响不能得出结论，以后的研究可以取不同年龄阶段的奶牛粪样来进行进一步验证。

3.3 大理地区奶牛感染内阿米巴原虫种类及遗传进化分析

在对18S rRNA基因的序列进行Blast比对时发现，有32份样品为E.bovis，2份样品为Entamoebasp.MG107/BEL，E.bovis为大理地区奶牛感染内阿米巴原虫的优势种，结果符合Stensvold C R等[16]的研究，即牛科动物中内阿米巴原虫感染的流行虫种为E.bovis。目前从牛体内检测出的内阿米巴原虫种类有E.bovis、Entamoebasp.RL2、Entamoebasp.RL4、Entamoebasp.RL5、Entamoebasp.RL9、E.moshkovskii和Entamoebasp.MG107/BEL[12,17]。国际上报道的从奶牛体内检出的内阿米巴原虫种类只有E.bovis[18]。本试验检测结果发现大理地区奶牛主要感染E.bovis，符合前人的研究，同时还检出了Entamoebasp.MG107/BEL感染，丰富了奶牛可感染内阿米巴原虫虫种。内阿米巴原虫分布范围广泛，易感动物较多[19]，目前国际上仅公认E.histolytica是唯一具有致病性的内阿米巴原虫[20]，对动物和人具有侵袭性。但也有学者提出内阿米巴原虫其他虫株虽然不具有致病性，但是在某些病原体作用下，可能会加重疾病严重程度。根据遗传进化树分析显示，本研究获得的多个序列，均与参考序列E.bovis聚在同一分支，最后与内阿米巴原虫其他种属汇成一大分支。虽然目前研究及进化树皆显示E.bovis不属于人畜共患内阿米巴原虫虫种，但是对于此虫种可能携带传播其他病原体的作用不能忽视。

3.4 大理地区奶牛内阿米巴原虫的防治

水源性和食源性传播是内阿米巴原虫主要传播方式，同时鼠类和昆虫能作为传播媒介，这就导致内阿米巴原虫很容易在人和动物中自然传播[5]。本次调查发现大理3个地区奶牛均存在内阿米巴原虫感染，因此，应引起重视，并加强防控。首先，在奶牛日常管理中，应保持饮水和养殖环境卫生，消灭养殖场周围鼠类和昆虫，切断传播途径；同时，对于规模化奶牛场应该及时清理粪便，做好无害化处理，避免对养殖环境造成污染；对于散养户应该加强防控宣传，做好个人防护；奶牛和养殖人员接触较多，应同时对人和奶牛进行定期检查；大理州气候温暖湿润，要做好牛舍防雨和垫料干燥处理；对于已感染内阿米巴原虫的奶牛选用甲硝唑进行隔离治疗，当粪便中无内阿米巴原虫检出1周后才可放回牛舍中饲养。

本次检测结果表明，在云南大理地区奶牛中存在E.bovis和Entamoebasp.MG107/BEL感染，丰富了奶牛感染内阿米巴原虫虫种，其中E.bovis为大理地区中奶牛感染内阿米巴原虫的优势虫种。虽然E.bovis并不感染人，但有研究表明内阿米巴原虫可携带其他病原体，与其他病原体协同作用加强疾病反应，从而影响人和动物的健康，因此需要引起注意并加强防控。本研究结果明确了云南大理地区奶牛内阿米巴原虫的流行情况和主要种属，为制定有效的防控措施提供数据支持。