绵羊干扰素调节因子1基因克隆、序列分析及真核表达

魏立翔，解艺璇，高之煜，曹鑫艳，张彦兵，孙延鸣

(石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003)

干扰素调节因子(interferon regulatory factors，IRFs)是一类在天然免疫和适应性免疫调控中均发挥作用的转录因子，IRFs广泛表达于免疫细胞[1]。在哺乳动物中，该家族成员包括IRF1～IRF9，具有抗病毒、免疫调节以及生长调控等功能[2]。其中，干扰素调节因子1(interferon regulatory factor 1，IRF1)是干扰素(interferon，IFN)通路中的重要组成部分，可激活IFN和核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)启动子[3]。IRF1的转录活性取决于其基因N端的DNA结合区域(DNA binding domain，DBD)，由115个氨基酸组成，通过DBD结构，IRF1基因可以结合到DNA上，从而发挥调控功能[4]。IRF1是最早被认为可以激活IFN-β的转录因子，后来被证实IRF1可以与IFN-β基因启动子区域的干扰素调节元件(interferon stimulated responsive elements，ISREs)结合，从而调控该基因的表达[5]。

静息状态细胞中IRF1常以低水平表达，当机体受病毒感染时，IRF1表达显著上调，激活1型IFN的启动子，触发由IFN介导的抗病毒反应[6-7]。同时也有研究发现，新佛朗西丝菌感染细胞时，IRF1可通过驱动鸟苷酸结合蛋白(guanylate binding proteins，GBPs)的表达，使细菌在细胞内被杀死[8]。绵羊支原体肺炎是一种由绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae，MO)引起的呼吸道疾病，以咳嗽、气喘、进行性体重减轻和肺间质增生炎症为主要特征[9]，严重威胁我国养羊业发展；前期数据发现，MO感染能诱导绵羊肺部IRF1差异表达[10]。然而，绵羊IRF1基因尚未克隆，以及绵羊IRF1功能尚不清楚。

本研究旨在克隆绵羊IRF1基因ORF，对其进行生物信息学分析，构建IRF1真核表达载体,以期为探索绵羊IRF1功能提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和质粒 HEK293T为本实验室保存；DH5α感受态细胞，购自天根生化科技(北京)有限公司；真核表达载体p3×Flag-CMV-14，购自上海康朗生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂 Trizol，英潍捷基有限公司产品；DNA分子质量标准DL 2000，反转录试剂盒，LATaq酶，Hind Ⅲ、EcoRⅠ限制性内切酶，TaKaRa公司产品；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，南京诺维赞生物科技有限公司产品；质粒小提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；小鼠抗FLAG-M2抗体，Sigma公司产品；HRP标记的羊抗鼠IgG，上海圣尔生物科技有限公司产品；超敏ECL发光试剂盒，上海圣尔生物科技有限公司产品；LipofectamineTM2000，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 Micro21低温高速离心机、ABI-2720 PCR扩增仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品；Alpha紫外凝胶成像仪，美国Protein Simple公司产品；PowerPac基础型核酸电泳仪，美国Bio-Rad公司产品；恒温培养箱，Thermo Fisher生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中预测的绵羊IRF1基因序列(登录号：NM_001009751.1)，使用Primer5.0软件设计扩增引物，上游引物添加了HindⅢ酶切位点，序列为：5′-ccAAGCTTatgcctatcactcggatgcgcatgagacc-3′；下游引物添加了EcoRⅠ酶切位点，序列为：5′-cgGAATTCtggtgcacaaggaatggcctggatggagggc-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 绵羊IRF1扩增及鉴定 采集感染MO绵羊肺脏组织，用Trizol法提取绵羊肺组织总RNA，按照反转录酶试剂盒说明合成cDNA。以反转录的cDNA为模板，扩增绵羊IRF1基因。PCR反应体系为50 μL：2×LATaqmix 25 μL，肺组织cDNA 2 μL，上、下游引物各2 μL，ddH2O 19 μL；PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃ 20 s，56℃ 20 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 7 min。PCR产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，回收DNA并测序。

1.2.3 绵羊IRF1生物信息学分析 使用DNAMAN软件对测序的基因序列进行拼接，获得绵羊IRF1 ORF基因全长序列，将IRF1全长序列提交GenBank(登录号：MZ959373)。从GenBank数据库中搜索不同物种的IRF1 氨基酸序列，使用ClustalX2、DNAstar软件对山羊、猪、人、马氨基酸序列进行比对；利用MEGA7软件构建系统进化树；使用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)在线程序对绵羊IRF1蛋白的氨基酸组成、分子式、等电点等进行分析；使用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在线软件对绵羊IRF1蛋白的信号肽和跨膜结构域进行分析；使用NetPhos2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)、NetNGlyc1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/)在线软件对绵羊IRF1蛋白的磷酸化位点和糖基化位点进行预测。

1.2.4 重组质粒p3×Flag-CMV-14-IRF1构建和鉴定 利用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ对测序正确的PCR产物和p3×Flag-CMV-14载体分别双酶切，纯化回收后连接。连接体系20 μL，包括T4 DNA连接酶1 μL、线性化载体3 μL、纯化的片段14 μL、10×Ligation buffer 2 μL，16℃金属浴过夜连接；将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于氨苄西林抗性平板，挑选阳性单菌落液体培养后提取质粒。IRF1质粒双酶切验证后，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.5 绵羊IRF1质粒转染及蛋白样品制备 HEK293T细胞接种6孔板，过夜培养，使用LipofectamineTM2000将重组阳性质粒p3×Flag-CMV-14-IRF1质粒转染细胞，同时将空质粒p3×Flag-CMV-14转染至HEK293T细胞设为空白对照组，转染24 h后，收获细胞。蛋白裂解液裂解细胞，沸水浴5 min，超声处理裂解，12 000 r/min离心10 min，吸取上清与5×SDS loading buffer混合，沸水浴10 min；蛋白样品保存-20℃。

1.2.6 蛋白免疫印迹试验 将蛋白样品进行100 g/L SDS-PAGE电泳，电泳结束后使用湿转印法将蛋白转印到NC膜，用50 g/L的脱脂乳于室温封闭2 h～3 h，用1×TBST对NC膜漂洗3次，加入小鼠抗-FLAG 抗体(1∶4000)，4℃孵育过夜，用1×TBST洗涤3次后，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶6000)，室温孵育50 min，用1×TBST洗涤3次后，用ECL显色发光试剂盒进行显色。

2 结果

2.1 绵羊IRF1扩增及鉴定

用PCR成功扩增出绵羊IRF1基因ORF，大小为969 bp，与预期大小相符(图1)。克隆的绵羊IRF1 ORF基因序列与GenBank中预测的绵羊IRF1 ORF基因序列一致，表明成功克隆绵羊IRF1基因ORF。

M.DNA标准DL 2000；1.绵羊IRF1的PCR扩增产物M.DNA Marker DL 2000；1.PCR product of sheep IRF1图1 绵羊IRF1 PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of sheep IRF1

2.2 绵羊IRF1生物信息学分析

2.2.1 绵羊IRF1氨基酸序列与其他物种的比对分析 用绵羊IRF1氨基酸序列与山羊(XP 005682678.1)、猪(NP 001090882.1)、人(P10914.2)、马(XP 005599497.1)氨基酸序列进行比对，相似性分别为100%、91.61%、87.73%和89.44%。绵羊与上述几个物种IRF1 前117个氨基酸序列完全一致(图2)。

阴影标记的区域为同源性氨基酸，黑色阴影区代表氨基酸同源性为100%，灰色阴影区代表同源性为75%以上。The shaded areas are homologous amino acids,the black shaded areas represent 100% homology of amino acids,and the gray shaded areas represent more than 75% homology of amino acids.图2 绵羊IRF1氨基酸序列的多重比对Fig.2 Multiple alignment of the amino acids sequences of sheep IRF1

2.2.2 系统进化树构建 利用绵羊、山羊、牛、猪、白鳍豚、马、人、小鼠、大鼠、鸡、鸽子、斑马鱼等的IRF1氨基酸序列构建进化树。结果显示，哺乳动物IRF1、鸟类IRF1分为两大支，说明哺乳动物之间IRF1亲缘关系较近，而与鸟类IRF1亲缘关系较远；绵羊、山羊、牛IRF1聚为一支，绵羊等IRF1与小鼠、大鼠IRF1亲缘关系较远，在不同的分支(图3)。

图3 不同物种IRF1系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic of sheep IRF1 sequences predicted by different species

2.2.3 绵羊IRF1理化性质 绵羊IRF1基因ORF为969bp，编码322个氨基酸。其中带负电荷氨基酸残基数(Asp+Glu)为44个，带正电荷氨基酸残基数(Arg+Lys)为39个，Ser、Pro、Glu、Leu含量比较高，分别为10.2%、9.0%、7.1%和7.1%(表1)；分子式为C1596H2497N435O497S17，理论等电点为5.58，属于弱酸性蛋白；绵羊IRF1蛋白有一个潜在的N-糖基化位点，存在于第163位氨基酸，潜在值为0.602 1。此外，绵羊IRF1蛋白无信号肽和跨膜结构。

表1 绵羊IRF1氨基酸组成Table 1 Amino acid composition of sheep IRF1

2.2.4 绵羊IRF1磷酸化位点预测 使用NetPhos2.0 Server对绵羊IRF1磷酸化位点进行预测，结果显示该蛋白存在多个潜在的磷酸化位点，绵羊IRF1蛋白可能具有较高的磷酸水平(图4)。

图4 绵羊IRF1蛋白磷酸化位点预测Fig.4 Phosohorylation site prediction of sheep IRF1 protein

2.3 绵羊IRF1 真核表达载体构建和鉴定

利用限制性内切酶对重组质粒p3×Flag-CMV-14-IRF1双酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测，发现2条条带(图5)，其中大小约为6 310 bp的为p3×Flag-CMV-14载体条带，大小约为969 bp的是绵羊IRF1条带；进一步测序分析，测序结果与预测的绵羊IRF1 基因序列一致，表明成功构建p3×Flag-CMV-14-IRF1重组质粒。

M.DNA标准DL 15 000；1.重组质粒p3×Flag-CMV-14-IRF1；2.重组质粒p3×Flag-CMV-14-IRF1 HindⅢ、EcoRⅠ双酶切M.DNA Marker DL 15 000；1.p3×Flag-CMV-14-IRF1 recombinant plasmid；2.p3×Flag-CMV-14-IRF1 recombinant plasmid digested by HindⅢ and EcoRⅠ图5 重组质粒p3×Flag-CMV-14-IRF1酶切图Fig.5 Enzyme digestion of recombinant plasmid p3×Flag-CMV-14-IRF1

2.4 IRF1重组蛋白的表达分析

绵羊IRF1真核表达质粒转染细胞，利用Western blot方法检测IRF1重组蛋白表达水平。结果显示p3×Flag-CMV-14-IRF1质粒在细胞中高效表达，绵羊IRF1大小为50 ku左右，与预期大小一致，可用于后续试验。

1.转染空载体(500 ng)；2.转染p3× Flag-CMV-14-IRF1 (250 ng)；3.转染p3× Flag-CMV-14-IRF1 (500 ng)1.Transfection of empty vector(500 ng);2.Transfection of p3× Flag-CMV-14-IRF1 (250 ng);3.Transfection of p3× Flag-CMV-14-IRF1 (500 ng)图6 绵羊IRF1蛋白过表达分析Fig.6 Analyzed over expression of sheep IRF1 protein by Western blot

3 讨论

干扰素调节因子家族在干扰素的产生中发挥重要的调控作用，其中IRF1参与宿主对病原微生物的天然免疫和适应性免疫，具有调控IFN-β表达的功能[7]。然而，绵羊的IRF1基因尚未克隆鉴定。本研究成功克隆了绵羊IRF1 ORF，对克隆的序列进行了生物信息学分析，并构建了绵羊IRF1的真核表达载体，通过质粒转染成功表达了绵羊IRF1重组蛋白。

IRF1具有和其他干扰素家族成员相同的结构特点，其N端编码DNA结合区域(DNA binding domain,DBD)的氨基酸在结构和功能上高度保守[11-12]。通过氨基酸序列比对发现，绵羊、山羊、人、马、猪的IRF1前117个氨基酸高度保守，其中，克隆的绵羊IRF1氨基酸序列与山羊的完全一致。系统进化树分析可见，哺乳类、鸟类、鱼类的IRF1处于不同分支。

在成功克隆绵羊IRF1 后，构建IRF1真核表达载体，转染哺乳动物细胞，初步探索IRF1蛋白特性。绵羊IRF1真核表达结果显示，IRF1蛋白显示分子量不同的两个条带，推测较大的条带是磷酸化的IRF1，这一结果与绵羊IRF1磷酸化预测结果相吻合，即在绵羊IRF1蛋白上预测到较多的磷酸化位点。另外，IRF1作为一种核转录因子，一般要经过磷酸化修饰后进入细胞核发挥功能。因此，本研究构建的绵羊IRF1真核表达质粒，可用于后续关于绵羊IRF1功能的研究。

IRF1在宿主抵御病原体方面发挥着重要作用。分支杆菌感染巨噬细胞可刺激IRF1表达，IRF1又激活下游免疫应答基因发挥抗分支杆菌的作用[13]。研究表明，猪繁殖与呼吸综合征病毒感染通过上调IRF1表达激活TNF-α启动子，从而促进猪肺部TNF-α高水平转录[14-15]。此外，肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1)也可参与诱导IRF1和IFN-β的表达增加[16]。值得注意的是，MO感染绵羊诱导产生高水平的TNF-α，绵羊肺部IRF1上调表达[9]。那么，在MO感染中绵羊IRF1是否能激活TNF-α启动子促进其转录，需要进一步研究。

本研究克隆、分析了绵羊IRF1基因，并构建了绵羊IRF1真核表达载体，成功表达出了绵羊IRF1的重组蛋白，为探究MO感染中绵羊IRF1功能提供了材料。