饲粮添加有机硒和铁对育肥猪肉品质、抗氧化特性以及关键转运载体基因表达的影响

2022-10-12韩萌萌龚赛明殷运菊舒剑成郭秋平李凤娜

动物营养学报 2022年9期

韩萌萌龚赛明殷运菊罗杰舒剑成邓敦沈康郭秋平李凤娜*

(1.中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室，动物营养生理与代谢过程湖南省重点实验室，长沙410125；2.中国科学院大学，北京100049；3.湖南农业大学动物科学技术学院，长沙410128；4.唐人神集团股份有限公司，株洲412007)

硒和铁是维持人和动物健康必需的微量元素，在机体内参与多种生物学过程，如维持机体免疫、调节氧化还原反应等。硒是25种硒蛋白的主要成分，其中大部分具有抗氧化和免疫功能[1]。通常来说，有机硒比无机硒有更高的生物利用度和生物功能价值[2-3]。白雪等[4]研究表明，酵母硒相对于亚硒酸钠在提高机体脏器硒含量及维持肉质保鲜储存方面效果更佳。铁在体内主要存在于血液、肝脏、脾脏和肌肉中，60%～70%的铁元素分布在血红蛋白中，2%～20%的铁元素分布在肌红蛋白(myoglobin，Mb)中，剩余的铁以铁蛋白(转铁蛋白、乳铁蛋白等)、血铁黄素和各种酶、细胞色素等形式存在[5]。氨基酸螯合铁具有氨基酸和铁元素双重营养作用，生物利用效价高，更易被机体吸收[6]。研究表明，适量添加氨基酸螯合铁可显著改善猪的生产性能、免疫机能和肉色[7]。随着生活水平的不断提高，消费者更加追求优质猪肉，不仅要求肉品外观表现好，而且对营养价值也有着更高的要求。因此，本试验以育肥猪为研究对象，通过在基础饲粮中添加酵母硒和甘氨酸亚铁，探讨有机硒和铁对育肥猪肉品质、组织硒含量、抗氧化特性以及铁、硒关键转运载体基因表达水平的影响，旨在为生产优质猪肉产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用添加剂酵母硒、甘氨酸铁、亚硒酸钠和硫酸亚铁均为市购。

1.2 试验动物与分组

试验选用体况良好、体重约70 kg的“杜×长×大”三元杂交育肥猪240头，采用单因素试验设计,按体重及遗传背景基本一致的原则随机分成2个组，每组6个重复，每个重复20头猪(公母各占1/2)。

1.3 饲粮及饲养管理

本试验在湖南省群丰试验猪场进行。参照NRC(2012)猪营养需要配制饲粮，对照组饲粮中添加亚硒酸钠和硫酸亚铁，试验组饲粮中添加酵母硒和甘氨酸亚铁，硒含量均为0.30 mg/kg，铁含量均为100 mg/kg。饲粮组成及营养水平见表1。试验猪自由采食和饮水，消毒和免疫等按照猪场常规程序进行。试验预试期3 d，正试期60 d。

表1 饲粮组成及营养水平(风干基础)

1 Items Content Total100.00 Nutrient levels2) DE/(MJ/kg)13.56 CP13.51 Lys0.94 Met0.28 Thr0.59 Try0.17 AP0.35 Ca0.69

1.4 样品采集与处理

试验结束时，每组随机选取10头猪运往当地屠宰场(唐人神集团)进行屠宰和样品采集。颈静脉采血后，血液样品静置0.5 h后离心分离血清，用于后续检测血清抗氧化酶活性和微量元素含量；取右半边胴体的背最长肌和股二头肌组织用于现场检测肉品质感官指标和后续肌肉化学组成、微量元素含量的分析，另取背最长肌样品于液氮速冻后保存于-80 ℃，用于分子生物学检测。

1.5 指标测定及其方法

1.5.1 生长性能的测定

试验开始和结束时，称量并记录各组猪的体重，统计出每个重复的总采食量，计算得出平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.5.2 胴体性状的测定

空腹称量宰前活重，电击后屠宰开膛并称量胴体重(去头、蹄、尾及内脏，保留板油和肾脏的躯体重量)，计算屠宰率(胴体重与宰前活重之比)；测量吊挂左半胴体的胴体斜长(由第1肋骨与胸骨结合处至耻骨联合中线的距离)和胴体直长(由枕寰关节底部前缘至耻骨联合前缘中线的距离)。用手术刀分离2片胴体上的板油，称量重量后计算板油率[100×(板油重/胴体重)]。用游标卡尺测量背膘厚(第1肋骨、第6～7肋骨及最后腰椎处，计算3处背部皮下脂肪厚度的平均值)。用游标卡尺测量第6～7肋骨背最长肌横断面的宽度和高度，计算眼肌面积(宽度×高度×0.7)。

1.5.3 肉品质的测定

参照中华人民共和国农业行业标准NY/T 821—2019《猪肉品质测定技术规程》进行背最长肌肉色评分和大理石纹评分；采用手持pH计(Matthaus pH Star,德国)、色差计(CR-410,Kinica Minolta Sensing Inc.,Osaka,日本)分别测定宰后背最长肌45 min和24 h的pH以及肉色亮度(L*)、红度(a*)和黄度(b*)值；采用质构仪(TMS-Pro,FTC,美国)测定宰后背最长肌的剪切力；采用悬挂法测定滴水损失，以及采用蒸煮法测定蒸煮损失。

1.5.4 肌肉化学组成的测定

肌肉样品的干物质(DM)、肌内脂肪(IMF)和粗蛋白质(CP)含量分别参照中华人民共和国国家标准GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》、GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》和GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》规定的方法进行测定。

1.5.5 血清抗氧化指标的测定

血清总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)采用南京建成生物工程研究所生产的商业试剂盒检测，血清过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量均采用长沙奥基生物科技有限公司生产的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测，并严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5.6 微量元素含量的测定

微量元素铁、硒含量测定采用微波消解法进行样品前处理，铁元素含量采用电感耦合等离子发射光谱仪(Agilent 5110 ICP-OES,美国)测定，硒元素含量采用电感耦合等离子体质谱仪(Agilent 7900 ICP-MS,美国)测定，步骤如下：肌肉样品切薄片冻干72 h，粉碎后称取0.25 g左右，记录数值，然后用称量纸将样品送入消解管底部(血清样品直接取1 mL左右于消解管中)。在通风橱内用玻璃注射器加入5 mL浓硝酸，1 mL过氧化氢(H2O2)，然后将样品放入微波消解仪，消解程序设定为150 ℃ 10 min、180 ℃ 5 min、200 ℃ 25 min。消解结束后每管加0.4 mL高氯酸，并用赶酸仪(BHW-09A45)继续操作，冷却后用超纯水冲洗并转移至50 mL容量瓶中定容，用0.45 μm水系滤膜过滤杂质，4 ℃冰箱保存待测。

1.5.7 肌肉中铁、硒关键转运载体基因表达的测定

采用TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA,美国)提取肌肉组织中的总RNA，用NanoDrop 2000分光光度计(NanoDrop Technologies,Inc.,Wilmington,DE,美国)测定总RNA浓度及在260和280 nm处的吸光度(OD)值，所有样品的RNA浓度用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水调至1 000 ng/μL左右，利用RNA反转录试剂盒(TaKaRa Biotechnology Co., Ltd.,大连)，按照说明书步骤合成cDNA，以合成的cDNA为模板采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法测定背最长肌组织中铁、硒关键转运载体相关基因的mRNA表达水平，引物序列(表2)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因，按照2-ΔΔCt法(ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCtGAPDH)计算各目的基因的mRNA相对表达量[8]。

1.6 数据统计分析

利用SPSS 22.0统计软件的独立样本t检验法进行组间差异性比较，试验数据采用“平均值±标准误”表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，0.05

2 结果

2.1 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪生长性能的影响

由表3可知，与对照组相比，饲粮添加有机硒和铁对育肥猪平均日增重、平均日采食量和料重比均无显著影响(P>0.05)。

表2 RT-PCR引物序列

表3 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪生长性能的影响

2.2 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪胴体性状的影响

由表4可知，与对照组相比，试验组育肥猪胴体斜长有增加的趋势(P=0.08)；试验组育肥猪胴体重、屠宰率和眼肌面积等均略有增加，而背膘厚和肾周脂肪含量均有所降低，但差异均不显著(P>0.05)。

表4 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪胴体性状的影响

2.3 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪肉品质的影响

由表5可知，与对照组相比，饲粮添加有机硒和铁显著提高育肥猪宰后24 h背最长肌的肉色a*值和肉色评分(P<0.05)，对其他肉品质感官指标无显著影响(P>0.05)。

表5 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪肉品质的影响

2.4 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪肌肉化学组成的影响

由表6可知，与对照组相比，饲粮添加有机硒和铁显著提高育肥猪股二头肌中的CP含量(P<0.05)，同时有提高背最长肌中的DM含量的趋势(P=0.05)，对背最长肌和股二头肌的IMF含量无显著影响(P>0.05)。

2.5 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪血清抗氧化指标的影响

由表7可知，与对照组相比，饲粮添加有机硒和铁显著或极显著提高育肥猪血清T-AOC(P<0.05)和GSH-Px活性(P<0.01)；试验组血清SOD活性有所提高，血清MDA含量有所降低，但均无显著差异(P>0.05)。

表6 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪肌肉化学组成的影响

表7 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪血清抗氧化指标的影响

2.6 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪血清和肌肉组织中矿物元素含量的影响

由表8可知，与对照组相比，饲粮添加有机硒和铁显著或极显著提高育肥猪血清、背最长肌和股二头肌中硒含量(P<0.05或P<0.01)，同时极显著提高血清中铁含量(P<0.01)，有提高股二头肌中铁含量的趋势(P=0.08)。铁元素在肌肉组织中高低顺序为：股二头肌>背最长肌；硒元素在肌肉组织中高低顺序为：背最长肌>股二头肌。

表8 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪血清和肌肉组织中矿物元素含量的影响

2.7 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪肌肉中铁、硒关键转运载体基因表达的影响

由表9可知，与对照组相比，饲粮添加有机硒和铁显著或极显著提高育肥猪肌肉组织中Mb、铁调节蛋白1(IRP1)、转铁蛋白(TF)和转铁蛋白受体1(TFR1)的mRNA相对表达量(P<0.05或P<0.01)，同时显著提高肌肉组织中谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)、硒蛋白W(SELENOW)和硒蛋白P(SELENOP)的mRNA相对表达量(P<0.05)。

表9 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪肌肉中铁、硒关键转运载体基因表达的影响

3 讨论

3.1 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪生长性能和胴体性状的影响

硒、铁作为动物必需的2种微量元素，对猪的生长、免疫和繁殖等方面都有着重要作用，机体缺乏这2种微量元素将会产生各种不良症状[5,9]。本试验结果显示，饲粮添加有机硒和铁对育肥猪的生长性能并无显著影响，这与Mahan等[10]和卓钊等[11]的研究结果一致。胴体重、胴体斜长及屠宰率是衡量动物屠宰性状的重要指标，背膘厚度和眼肌面积则反映胴体瘦肉率[12]。部分研究表明，饲粮添加不同硒源和硒水平(0.1～0.5 mg/kg)都不会对猪的生长性能或胴体性状产生显著影响[10,13-14]。Szudzik等[15]对不同品种、不同生长阶段的猪进行补铁，发现可有效改善仔猪缺铁性贫血和维持正常的生长性能，但对生长育肥猪胴体性状没有显著影响。本试验中，试验组和对照组育肥猪胴体性状均无显著差异，与上述研究报道结果一致。但也有研究显示，饲粮添加有机硒可显著改善育肥猪胴体相关指标，显著增加眼肌面积[16-17]。不同动物个体对微量元素的需求量和利用率不同，微量元素添加剂的量和形式不同可能是导致结果存在差异的原因。

3.2 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪肉品质的影响

肉色、pH、系水力和大理石纹等是反映猪肉品质的表观指标，这些指标直接影响消费者的购买选择。肉色是最直观的肉质指标，肌肉中的Mb含量是肉色a*值的决定因素，铁是合成Mb必需的微量元素，相比于无机铁，在饲粮中添加有机铁可有效改善断奶仔猪的肉色a*值[11]。Lin等[18]研究发现，提高饲粮中的铁含量(150 mg/kg FeSO4)可显著改善黄羽肉鸡肌肉的肉色a*值。硒是GSH-Px的重要组成部分，可促进清除自由基，有效防止Mb或氧合肌红蛋白(MbO2)氧化成高铁肌红蛋白(MetMb)，改善肉色[9]。与无机硒相比，饲粮添加酵母硒可更好地改善猪背最长肌的颜色[19-20]，但也有研究发现饲粮添加不同硒源对育肥猪背最长肌45 min a*值和24 h a*值无显著影响[21]。本研究结果发现，饲粮添加有机硒和铁可显著提高育肥猪背最长肌24 h a*值、肉色评分以及Mb的mRNA相对表达量，推测铁元素的利用率提高，并通过调节Mb的表达水平从而影响猪肉的肉色a*值，而有机硒则可能通过改善肌肉的抗氧化性能，对肉色的保护发挥促进作用。

3.3 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪肌肉化学组成的影响

本研究结果发现，与对照组相比，试验组育肥猪股二头肌中的CP含量显著升高。有研究表明，给猪饲喂高硒饲粮会激活单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)相关通路和硒蛋白在不同组织间的不同反应，在调节机体蛋白质和脂质代谢方面发挥作用，最终提高肌肉中的蛋白质含量[22]。王力[23]研究发现，饲粮中添加一定剂量的酵母硒可以通过上调鱼类肌肉中SELENOW的表达，加快蛋白质的沉积，这与本试验结果一致。铁元素是合成铁硫蛋白(Fe-S)必备的微量元素，Fe-S对高效合成蛋白质所需的线粒体中转运RNA的修饰有着极其重要的作用[24]。由此推测，硒和铁元素相互关联，协同提高肌肉组织的蛋白质含量。

3.4 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪血清抗氧化指标的影响

生物体内有SOD、CAT和GSH-Px等酶类抗氧化系统，部分微量元素参与抗氧化酶的活性构成。硒通过硒蛋白的形式在体内发挥生物学功能，其中抗氧化是硒蛋白的重要功能之一[1]。研究表明，饲粮中添加不同水平的酵母硒能显著提高育肥猪血清中T-AOC和总超氧化物歧化酶(T-SOD)、GSH-Px、CAT的活性并降低MDA含量[20]，有机硒在改善肉兔、湖羊和鱼类等不同动物机体抗氧化性能上也具有明显效果[4,25-26]。GSH-Px是常见的含硒抗氧化酶之一，国内外学者均发现给动物饲喂有机硒，可提高其体内GSH-Px的表达量，进而提高此酶活性，增强机体的抗氧化能力[4,27-28]。铁是CAT、SOD发挥正常功能的必需元素[29]，SOD的作用是将活性氧基团转化为H2O2，而CAT负责破坏过量的H2O2。Kwiecień等[29]研究发现，用蛋氨酸螯合铁代替50% FeSO4提高了鸡胸肉的T-AOC。本研究结果显示，与对照组相比，试验组育肥猪血清GSH-Px活性极显著提高，肌肉组织中GPX1的mRNA相对表达量显著提高，推测硒是影响此酶活性的关键元素；而试验组血清T-AOC显著提高，说明饲粮中同时添加有机硒和铁比无机硒和铁在提高机体抗氧化能力上更有优势。

3.5 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪血清和肌肉组织中矿物元素含量的影响

饲粮添加不同硒源可显著影响猪肌肉和血清中硒的沉积部位及含量。张少涛[21]报道，饲喂0.3 mg/kg酵母硒的生长育肥猪肝脏、肾脏和背最长肌硒沉积量显著提高；与亚硒酸钠相比，酵母硒可以显著提高奶牛全血硒含量[30]，本试验结果与上述报道相符。另有研究表明，饲粮添加100 mg/kg的甘氨酸亚铁相比于硫酸亚铁有提高断奶仔猪血清铁含量的趋势[11]，这与本试验有机铁显著提高育肥猪血清中铁含量结果一致，同时本试验还发现股二头肌中铁含量也有提高的趋势。

3.6 饲粮添加有机硒和铁对育肥猪肌肉中铁、硒关键转运载体基因表达的影响

铁是构成Mb的必要元素，Mb对肉色的a*值起着决定性作用。铁调节蛋白(IRPs)是细胞内铁稳态重要调节蛋白，其可以通过与铁反应元件(IRE)的结合，对TFR1 mRNA进行转录后水平的调节[31]；肠道吸收的铁与TF、TFR1结合成holo-TF/TFR1复合物，经过受体介导的内吞作用内化，进入细胞参与生化反应[32-33]。本试验结果发现，与对照组相比，试验组育肥猪肌肉组织中IRP1、TF和TFR1 mRNA相对表达量显著升高，说明有机铁的利用效率更高，机体铁代谢增强。GPX1和SELENOW可以调节细胞内的氧化环境，广泛存在于机体各组织中[28,34]，SELENOP在生物体内起转运和储存硒的作用[35]。本研究结果表明，与对照组相比，试验组育肥猪肌肉组织中GPX1、SELENOP和SELENOW的mRNA相对表达量显著升高，这与Zhang等[36]和张凯[3]的研究结果一致。有机硒的生物利用率比无机硒更高，摄入同等水平的有机硒和无机硒，前者会显著上调关键硒蛋白的基因表达水平。