膜联蛋白A5在胰腺癌中的预后意义及机制的生物信息学分析

仲成成，李铭旭，张功铭，胡伟，王仲

（徐州医科大学附属连云港医院 1.肝胆外科 2.病理科， 江苏 连云港 222001）

胰腺癌是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，其病死率几乎与发病率相似[1-2]。胰腺癌早期症状不典型，许多患者确诊时，已经出现局部进展或远处转移，不适合手术，导致5年生存率低于11%[3]。此外，胰腺癌具有独特的肿瘤微环境[4]，缺乏有效的靶向治疗手段，使胰腺癌患者的预后较差。因此，寻找可靠的分子标志物对胰腺癌早期诊断及治疗均有重要意义。

膜联蛋白A5（ANXA5）是钙依赖磷脂结合蛋白家族的一员，通常存在于细胞质中，它可以与钙和磷脂结合，作为各种生理过程的内源性调节因子[5]。参与细胞信号转导、炎症、肿瘤增殖、转移和耐药等[6-8]。已有研究[9]表明，ANXA5可能通过抑制RTK-Ras/Raf/MEK/ERK信号通路中的蛋白激酶C（PKC）活性参与癌变过程。在肾癌[10]、肝癌[11]中发挥促癌基因的作用，但在胃癌[12]、宫颈癌[13]中发挥抑癌基因的作用。目前ANXA5在胰腺癌中的具体作用机制尚不清楚。

本研究利用TCGA和GEO数据库，分析ANXA5在胰腺癌中的表达情况，及其在胰腺癌中的预后意义，并通过基因集富集分析（gene sets enrichment analysis，GSEA）进一步预测其在胰腺癌中的信号通路，从而研究ANXA5在胰腺癌发生、发展中的作用机制。并通过免疫组织化学方法检测ANXA5在胰腺癌组织中的表达情况，分析其与胰腺癌临床病理特征的关系，并探讨其在胰腺癌中的预后价值。

1 资料与方法

1.1 数据集资料

下载并处理TCGA数据库（http://www.portal.gdc.cancer.gov）中179例胰腺癌患者的RNA-seq数据及临床病理资料；从GEO数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下载并处理3个胰腺癌数据集，包括GSE16515（平台为GPL570，由36个肿瘤样本和16个正常样本组成）、GSE21501（平台为GPL4133，由102个肿瘤样本组成）与GSE15471（平台为GPL570，由39个肿瘤样本和配对正常样本组成）。其中TCGA数据库与GSE21501数据集具有患者完整临床信息。

1.2 病例资料

选取采用的胰腺癌组织标本为徐州医科大学附属连云港医院2018年9月—2021年9月经病理确诊的49例胰腺癌患者的组织标本。患者临床数据特征见表1。胰腺癌临床分期按照国际抗癌联盟（UICC）第8版分期标准。所有入组患者术前均未接受任何针对肿瘤的治疗，术后未进行化疗及靶向治疗。本研究经我院医学伦理委员会批准（伦理审批号：KY20190924002），所有患者均签署知情同意书。

表1 ANXA5表达与胰腺癌患者临床特征的关系[n（%）]Table 1 Relationship between ANXA5 expression and clinical characteristics of patients with pancreatic cancer [n (%)]

1.3 免疫组织化学检查

手术切除的胰腺癌与癌旁组织标本经4%多聚甲醛固定包埋在石蜡后切成4 μm厚的切片。将切片在二甲苯中脱石蜡并在梯度乙醇中再水合。用3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶活性，并用3%山羊血清阻断非特异性结合。随后，将ANXA5一抗 （Affinity Biosciences有限公司，P08498，1∶100稀释）于组织切片上孵育，4 ℃下孵育过夜。将磷酸盐缓冲盐水孵育的切片设定为阴性对照。将切片与过氧化物酶缀合的二抗一起温育。二氨基联苯胺用作色原体，苏木素复染后，在200倍显微镜下观察并拍照。

1.4 免疫组化评分

由2名与本研究无关的病理医师采用双盲法独立评估免疫组化评分。免疫组化评分[14]由阳性细胞比率和染色强度组成，根据阳性细胞比率：＜25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；将ANXA5表达的阳性细胞比率和染色强度相乘，阳性细胞率与染色强度之积分为0～4分为ANXA5阴性表达，5～12分为阳性表达。

1.5 统计学处理

使用R 4.0.5软件进行统计学分析，采用Kaplan-Meier法绘制生存率曲线，采用Spearman相关分析基因间的相关性，0.1≤|r|≤1.0时定义为存在相关；对预后影响因素进行单多因素Cox回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义；使用GSEA4.1.0软件进行基因集富集分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ANXA5在胰腺癌中高表达

通过数据库分析ANXA5在肿瘤组织和非肿瘤正常组织中的表达水平，在GSE15471、GSE16515与TCGA数据库中，胰腺癌组织中的ANXA5表达量明显高于正常组织，差异有统计学意义（均P＜0.05）（图1A-C）。通过免疫组化法检测我院49例胰腺癌组织和癌旁组织中ANXA5的表达，胰腺癌组织较癌旁正常组织表达明显增高（P＜0.001），与上述数据库分析结果一致（图1D-F）。

图1 ANXA5在胰腺癌组织与正常组织的表达情况 A：GSE15471；B：GSE16515；C：TCGA；D：49例样本表达情况；E-F：免疫组化检测ANXA5的表达Figure 1 Expressions of ANXA5 in pancreatic cancer tissues and normal tissues in GSE database and TCGA database A: GSE15471; B: GSE16515; C: TCGA; D: Expression of ANXA5 in the 49 samples; E-F: Immunohistochemical staining for ANXA5 expression

2.2 ANXA5表达与胰腺癌患者生存的关系

在有临床信息的GSE21501和TCGA中，采用“survival”包绘制Kaplan-Meier生存率曲线，结果显示（图2），ANXA5的低表达与良好的预后明显有关（均P＜0.05），并根据免疫组化评分，以最佳截断值将49例胰腺癌患者分为高表达组与低表达组，其中高表达组20例，低表达组29例，分析患者预后信息，ANXA5高表达患者的预后明显差于低表达患者（P=0.008 2）。

图2 ANXA5表达与预后的关系 A：GSE21501中Kaplan-Meier生存率曲线；B：TCGA中Kaplan-Meier生存率曲线；C：49例样本的Kaplan-Meier生存率曲线Figure 2 Relationship between ANXA5 expression and prognosis A: Kaplan-Meier survival curve in GSE21501; B: Kaplan-Meier survival curve in TCGA; C: Kaplan-Meier survival curve of the 49 samples

2.3 胰腺癌预后影响因素

为分析ANXA5表达与临床病理因素对于胰腺癌预后的关系，在TCGA、GSE21501与我院49例样本中进行单因素Cox回归分析，结果显示在TCGA数据库中，ANXA5基因高表达是胰腺癌预后的危险因素（P=0.029），在我院49例样本中显示ANXA5表达（P=0.014）、临床分期（P=0.036）及性别（P=0.043）与胰腺癌预后相关。多因素Cox回归分析示在TCGA数据库中，ANXA5基因高表达是胰腺癌预后的危险因素（P=0.03），在我院49例样本中显示ANXA5高表达（P=0.041）是胰腺癌预后的独立危险因素。根据我院49例胰腺癌样本ANXA5表达的免疫组化评分（计量资料采用t检验）进一步分析其和临床病理参数的关系，ANXA5的表达与患者临床分期（P=0.000 94）及淋巴结转移（P＜0.001）有关（图3）；根据ANXA5表达阳性率（四格表χ2分析）提示ANXA5表达与淋巴转移相关（P＜0.001），而与性别、年龄、组织分化、临床分期、神经浸润无关，差异无统计学意义（均P＞0.05）（表1）。

图3 GSE21501与TCGA中单多因素Cox回归分析及49例样本中ANXA5表达与临床病理参数的关系 A：GSE21501中单多因素Cox回归分析；B：TCGA中单多因素Cox回归分析；C：49例样本中单多因素Cox回归分析；D-I：49例样本中ANXA5表达与临床病理参数的关系Figure 3 Univariate and multivariate Cox regression analysis of TCGA and GSE21501 and the relationship between ANXA5 expression and clinicopathological parameters in 49 samples A: Univariate and multivariate Cox regression analysis in GSE21501; B: Univariate and multivariate Cox regression analysis in TCGA; C: Univariate and multivariate Cox regression analysis in the 49 samples; D-I: The relationship between ANXA5 expression and clinicopathologic parameters in the 49 samples

2.4 胰腺癌中ANXA5基因通路富集分析

为了解胰腺癌患者ANXA5基因通路富集情况，使用GSEA4.1.0软件进行基因集富集分析，结果显示，在GSE21501数据集（P＜0.01）与TCGA数据库（P=0.04）均富集到TGF-β通路（图4）。

图4 GSEA富集分析中TGF-β通路情况 A：GSE21501；B：TCGAFigure 4 Enrichment analysis of the TGF-β pathway in GSEA A: GSE21501; B: TCGA

2.5 ANXA5基因与TGF-β通路及EMT的相关性

TGF-β通路促进细胞迁移、侵袭和转移的关键机制之一是诱导上皮-间充质转化（EMT），为了解ANXA5基因与TGF-β通路及EMT的关系，在GSE21501数据集与TCGA中选取TGF-β通路及EMT的相关基因，采用R软件绘制相关性热图，结果显示，ANXA5基因与TGF-β通路的TGFB1、TGFBR1、TGFBR2、SMAD4基因均正相关（结果均具有统计学意义），且在GSE21501数据集中，ANXA5基因与上皮标志物E-cadherin（CDH1）呈负相关，与间质标志物N-cadherin（CDH2）、VIM基因呈正相关，由此可表明ANXA5基因与TGF-β通路及肿瘤EMT转化有高度相关性（图5）。

图 5 ANXA5基因与TGF-β通路及EMT相关基因的相关性热图 A：GSE21501；B：TCGAFigure 5 Heat map of the relationship of the ANXA5 gene with the TGF-β pathway and EMT related genes A: GSE21501;B: TCGA

3 讨 论

胰腺癌是消化道恶性程度最高的肿瘤，诊断主要依靠高分辨率超声、内镜超声、计算机断层扫描或磁共振成像，除手术外，目前不能切除的胰腺癌主要以化疗[15]为主，包括单药吉西他滨，吉西他滨加纳米颗粒白蛋白结合紫杉醇，和FOLFIRINOX（叶酸，5-氟尿嘧啶，伊立替康，奥沙利铂），尽管如此，胰腺癌患者的预后仍然很差[16-17]。因此，挖掘新的生物标志物并研究胰腺癌发生、发展的分子机制是改善胰腺癌患者生存预后的重要措施。

ANXA5基因位于染色体4q28-q32，为1.6 kb长，分子量为35.8 kDa，包括12个外显子和1个内含子，参与多种生理病理过程[18]。近期研究[19]发现在接受常规化疗的儿童急性髓系白血病患者中，ANXA5的高表达与不良结局相关。另外研究[12]发现相较于癌旁正常组织，内源性ANXA5在胃癌组织中表达显著降低，但是无法解释的是ANXA5高表达的胃癌患者的总生存率显著低于ANXA5低表达的胃癌患者，ANXA5基因敲除可促进胃癌细胞增殖和转移，同时抑制胃癌细胞凋亡。目前在胰腺癌中尚缺乏针对ANXA5基因的研究，本研究基于生物信息学技术，在GEO数据集及TCGA数据库中分析了ANXA5在胰腺癌中的表达情况，并通过Kaplan-Meier生存率曲线评估其过表达对胰腺癌预后的价值。分析结果表明，ANXA5在胰腺癌组织中的表达显著高于正常组织，且高表达ANXA5基因的胰腺癌患者的预后更差。进一步单多因素的Cox回归分析表明，ANXA5高表达可以作为判断胰腺癌预后的危险因素。在49例胰腺癌患者组织中ANXA5的表达明显高于癌旁组织，且此基因高表达预示着较差的预后，与上述数据库结果一致。并且在有淋巴结转移患者中的表达要明显高于无淋巴结转移患者，表明了ANXA5与胰腺癌淋巴结转移呈正相关，提示ANXA5的高表达可能与胰腺癌细胞的迁移和侵袭相关。本研究结果与ANXA5在胃癌组织的研究说明ANXA5在不同癌症中既可以发挥抑癌基因作用，又具有促癌基因作用。

在小鼠肝癌研究[11]发现ANXA5可以通过ERK2/c-Jun/pc-Jun（Ser73）和ERK2/E-cadherin途径介导小鼠肝癌Hca-F细胞的体外恶性行为，证明ANXA5是肝癌Hca-F细胞系淋巴结转移中的重要分子和肝癌的潜在治疗靶标。在前列腺癌细胞中，ANXA5通过抑制NF-κB p65磷酸化来抑制COX-2的表达，ANXA5可能在细胞对促炎刺激的炎症反应中具有重要的保护作用，因此，将ANXA5的抗炎作用应用到前列腺癌治疗中，可以达到抑制肿瘤发展和改善耐药的效果[20]。然而，目前尚不清楚ANXA5在胰腺癌组织高表达的具体作用机制。GSEA基因集富集分析显示，在GSE21501数据集与TCGA数据库均富集到TGF-β通路，提示ANXA5基因可能通过TGF-β通路在胰腺癌中发生作用。

TGF-β信号通路参与到许多疾病的发病机制，如结缔组织疾病、纤维化和癌症[21]，参与了肝癌[22]、肺癌[23]、胃癌[24]等肿瘤的发生与发展。在小鼠模型中，通过抑制胆固醇途径可诱导TGF-β信号通路，从而促进胰腺癌基层分化[25]。所以检测胰腺癌中TGF-β信号通路活性具有重要作用。TGF-β信号通路活性检测主要包括TGFB1、TGF-β受体（TGFBR1、TGFBR2）及SMAD4基因[26-28]。有证据[29]显示，TGF-β通路促进细胞迁移、侵袭和转移的关键机制之一是诱导上皮-间充质转化（EMT）。EMT的标志是E-cadherin的缺失和Ncadherin、vimentin、slug、snail等的上调，这些对实现运动和侵袭特性至关重要，并允许细胞通过细胞外基质迁移并在远处形成转移[30-31]。本研究中，通过绘制ANXA5基因与TGF-β通路相关基因及EMT标志物的相关性热图，结果显示ANXA5基因与胰腺癌TGF-β通路相关基因及肿瘤EMT标志物高度相关，表明ANXA5基因可能通过TGF-β通路及诱导上皮-间充质转化（EMT）促进胰腺癌的发生、发展。

综上所述，高表达ANXA5可以作为判断胰腺癌预后的危险因素，其机制可能是通过TGF-β通路促进胰腺癌EMT转化，有望成为胰腺癌诊治的新靶点，但本研究关于ANXA5在胰腺癌中的作用机制仅为生物信息学分析，有待进一步实验验证。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。