三叶青叶表型多样性与地上部分总黄酮含量相关性

郭梦桥 陈轩宇 洪森荣 李 娇 樊 洁 程薪宇

（上饶师范学院生命科学学院，上饶 334001）

三叶青（Diels &Gilg），又名蛇附子、石老鼠、石猴子、金线吊葫芦等，为葡萄科（Vitaceae）崖爬藤属（），多年生草质藤本植物，全草或块根入药，具有抗肿瘤、消炎、调节免疫等功效。由于三叶青的抗癌作用与其黄酮类成分有关，因而目前对三叶青的研究主要侧重于其黄酮类化合物的分离鉴定及药理作用等方面的研究，总黄酮含量亦成为衡量三叶青种质资源（简称“资源”）品质优劣的重要指标之一。而对于三叶青种质资源多样性及品质比较的研究，则主要研究内容涉及分子标记、同工酶、色谱分析及农艺性状的比较分析等方面，例如朱波等发现不同三叶青资源的叶与根系农艺性状均存在显著差异，可作为三叶青种源地初步鉴定的判断依据。在此基础上，部分研究人员还发现三叶青种源地地理位置、生境与总黄酮含量存在一定相关性，如吉庆勇等发现丽水市不同海拔三叶青总黄酮含量随海拔升高呈先增高后降低的趋势。但此类研究涉及区域多相对较小，或仅以根部或叶长、叶宽等少量叶形性状为依据对少数几个资源进行比较和鉴别，而仅凭这些性状却不能满足对大量资源同时进行比较和鉴别的需要，且以根部性状为鉴别依据，会对植株造成严重损伤，不利于资源的保存，甚至可能影响育种速度。现有研究结果显示，同一作物不同资源间，叶形常存在较大差异，可作为资源鉴别依据，而不同资源间的叶形差异有时亦可在一定程度上反应资源间总黄酮含量上的差异。而对于三叶青资源间丰富多样的叶形变化而言，何种叶形性状更适于作为资源间鉴别依据，以及叶形性状对三叶青地上部分总黄酮含量是否具有指示作用，目前均无相关报道出现。鉴于此，本研究以引自我国12 个省（直辖市）的49份三叶青资源为材料，对各资源叶表型性状进行统计比较，并与各资源地上部分总黄酮含量进行相关性分析，意在揭示三叶青叶表型性状间的联系，确定叶表型性状在三叶青种质资源鉴别中的价值，以及其与种源地位置和总黄酮含量间的关系，为快速培育高黄酮含量的优质三叶青品种提供更为直观的形态学判断依据。

1 材料与方法

1.1 研究材料

为确保三叶青各资源叶形特征为其自身固有性状，而非受不同生长环境短期影响所致，本研究以2020 年10 月29 日采集于上饶市红日农业开发有限公司怀玉山三叶青引种园的49份三叶青种质资源地上部分为研究材料（所有资源均已于采集地栽种3年以上），各资源种源地信息见表1。

表1 三叶青种源地信息Table 1 The provenance information of T.hemsleyanum

1.2 研究方法

选择各资源长势旺盛植株，每株取5片远离茎末端的完全伸展叶，测量叶柄长、中叶长等12个叶表型长度性状（简称“长度性状”），并在此基础上，换算得到叶柄比等7 个叶表型比例性状（简称“比例性状”），取平均值，各资源设置6次重复，测量结果如表2所示。

取各资源地上部分鲜样（含茎、叶），50 ℃烘干至恒重（约72 h 以上），再将烘干所得干样粉碎后过100 目筛，作为总黄酮检测样品。总黄酮含量（total flavonoids content，TFC）检测方法参考马祥等，各资源重复测定3次。

利用SPSS 20.0 对三叶青叶长度性状、比例性状和种源地位置进行相关性分析，并提取叶长度性状公因子，利用公因子得分进行聚类分析以及三叶青叶表型性状和地上部分总黄酮含量的相关性分析。

2 研究结果

2.1 三叶青叶形差异

各资源叶长度性状统计分析显示，各资源叶形存在一定差异（见表2）。其中，中叶柄长变异系数最大（23.43%），中叶柄长最短的为ZJ-LSH，仅5.37 mm，最长的为HN-JSH，13.23 mm，为前者的2.5 倍以上；侧叶柄长变异系数仅次于中叶柄长（21.64%），其中最短的仅2.70 mm（JX-FCH），最长的6.70 mm（HN-JSH）；侧生叶叶片长度性状变异系数整体大于中生叶叶片，例如侧叶宽变异系数（16.33%）大于中叶宽变异系数（14.66%），侧叶长变异系数（13.66%）大于中叶长的变异系数（13.17%）；其余叶形长度性状变异系数由15.02～19.38%。

表2 三叶青叶长度性状及总黄酮含量（平均值±标准差）Table 2 Characters of leaf length and content of total flavonoids of T.hemsleyanum（means±SD）

2.2 三叶青叶长度性状与比例性状相关性

三叶青部分叶长度性状与比例性状相关性分析结果显示（见表3），叶柄长与中叶长宽比（相关系数-0.376）和侧叶长宽比（相关系数-0.390）呈极显著负相关（＜0.01），即叶柄长的资源，其叶片可能更为宽阔；中叶柄长和侧叶柄长与比例性状均无显著相关性；中叶长和中叶宽与中叶长宽比分别呈显著正相关（＜0.05，相关系数0.312）和极显著负相关（＜0.01，相关系数-0.500），即随着中叶叶片增大，其叶形逐渐朝狭长或短阔形发展；中叶宽与侧叶长宽比和侧叶下宽比分别呈极显著负相关（＜0.01，相关系数-0.432）和显著正相关（＜0.05，相关系数0.318），中叶长宽比与侧叶宽、侧叶上部宽和侧叶下部宽呈显著（＜0.05）或极显著（＜0.01）负相关，相关系数分别为-0.380、-0.343和-0.390，表明中生叶和侧生叶叶形存在相关性，中生叶增宽，侧生叶亦朝宽阔方向发展，反之亦然；侧叶长与叶比例性状无显著相关性。侧叶宽、侧叶上部宽和侧叶下部宽与侧叶长宽比呈极显著负相关（＜0.01），相关系数依次为-0.482、-0.475和-0.467，表明随着侧生叶宽度的增加，侧生叶叶形整体朝更宽阔方向过渡。

表3 三叶青叶长度性状与比例性状相关性Table 3 Correlation analysis of characters of leaf length with proportion of T.hemsleyanum

续表2 Continued table 2

2.3 三叶青种源地理位置与叶表观性状相关性

各资源种源地纬度、经度以及海拔与三叶青叶长度性状相关性分析结果显示（见表4），种源地纬度与叶柄长呈显著正相关（＜0.05，相关系数0.353），即随着种源地纬度升高，叶柄长整体呈增长趋势，而种源地纬度与中叶长、中叶宽距、侧叶上宽距呈显著负相关（＜0.05），相关系数依次为-0.318、-0.329、-0.287，具体表现为小叶由披针形或卵披针形向更为宽阔的长椭圆披针形过渡；种源地经度与三叶青叶长度性状无显著相关性；种源地海拔与侧叶柄长呈显著负相关（＜0.05），相关系数-0.302，即随着种源地海拔升高，三叶青侧叶小柄长度呈缩短趋势，叶片距离总叶柄更近。

表4 三叶青种源地与叶长度性状相关性Table 4 Correlation analysis of provenance with characters of leaf length of T.hemsleyanum

由各资源种源地纬度、经度以及海拔与叶比例性状相关性分析结果可知（见表5），种源地纬度与叶柄比呈极显著负相关（＜0.01，相关系数-0.451），与中叶长宽比（相关系数-0.301）、侧叶上宽比（相关系数-0.320）和侧叶下宽比（相关系数-0.293）均为显著负相关（＜0.05），具体表现为种源地纬度升高，三叶青叶柄逐渐增长，中生小叶变的更宽阔，侧生小叶叶片朝卵状椭圆形方向发展；种源地经度与侧叶上宽比（相关系数-0.285，）和侧叶上下宽比（相关系数-0.423）分别呈显著负相关（＜0.05）和极显著负相关（＜0.01），即表明伴随种源地向东推移，三叶青侧生叶不对称性更为明显；种源地海拔与叶比例性状无显著相关性。

表5 三叶青种源地与叶比例性状相关性Table 5 Correlation analysis of provenance with characters of leaf proportion of T.hemsleyanum

2.4 三叶青叶长度性状因子分析

三叶青部分叶长度性状与比例性状的相关性分析结果表明，长度性状间可能存在普遍的相关性，因此对部分叶长度性状进行因子分析。结果显示，KMO 测度值0.744，Bartlett 检验显著性值0.000，可进行因子分析。

因子分析结果显示（见表6），共有3个公因子特征值大于1，经过最大方差法旋转后得到的公因子载荷矩阵显示，3个公因子的累积贡献率达90.237%，涵盖了原变量的绝大部分信息。公因子1贡献率为55.257%，在侧叶宽、侧叶下部宽、侧叶上部宽、侧叶长、中叶宽和中叶长上有较大载荷，代表叶片性状；公因子2贡献率为21.558%，在侧叶柄长和中叶柄长上具有较大载荷，代表小叶柄性状；公因子3贡献率13.423%，在叶柄长上具有较大载荷，反应叶柄长度性状。各资源公因子得分及综合得分如表7所示。

表6 叶长度性状因子Table 6 Leaf length characters factor analysis

2.5 三叶青叶形聚类分析

以3个叶长度性状公因子得分为数据源，进行层次聚类，求得各资源叶形综合得分，最终将49个资源叶形划分为5 个类型（见表7），其中湖南、江西、浙江和湖北省中的8个资源构成一类（类型-1），该类叶形公因子综合得分平均值在0.55 以上，叶形大小整体处于中等或中等偏上水平，这8个资源为本研究涉及资源中公因子2得分最高的资源，表明该类叶形主要特点为小叶柄较长。

表7 三叶青叶长度性状公因子得分、综合得分及聚类分析结果Table 7 Common factor scores，comprehensive scores and cluster analysis results of T.hemsleyanum length characters

ANH-HSH等30个资源叶形归为一类（类型-2），种源地涉及了本研究中除云南省外的所有采集省（直辖市），其中以江西、广西和浙江资源相对较多，该类叶形公因子综合得分多为负值，平均得分-0.38，说明该类群叶形整体偏小，公因子1、公因子2 得分为负值的绝大部分资源叶形归入此类中，表明该类叶形主要特征为叶片较小、小叶柄较短。

JX-LHSH 和HN-JBX 等5 个资源叶形归为一类（类型-3），种源地涉及湖南、江西和浙江，公因子综合得分平均值为0.89，说明该类叶形整体偏大，多数资源公因子1、3 得分较高，表明该类叶形主要特征为叶片较大、叶柄较长，由叶长度性状测量结果（见表2）可知，此类叶形侧生叶较宽，中生叶与侧生叶叶片长宽比较小，即叶片短阔。

JX-YSH 等5 个资源叶形归为一类（类型-4），种源地涉及广西和江西两省，该类群的公因子综合得分平均值0.11，说明该类叶形大小在本研究涉及资源中整体处于中等水平。本研究所涉资源，公因子3得分最少的5个资源全为此类型叶，表明该类叶形主要特征为叶柄较短（平均仅22.76 mm）。

云南的YN-MLP叶形单独构成一类（类型-5），公因子综合得分最高（1.89），表明该类叶形为本研究中叶形整体最大的一类，其公因子1得分远高于其他资源，说明该类叶形主要特征为叶片较大，其中叶长、侧叶长、侧叶宽均大于其他资源，但中叶柄长和侧叶柄长在本研究资源中仅处中等水平。

2.6 三叶青地上部分总黄酮含量与种源地位置和叶形公因子的相关性

49个资源地上部分总黄酮含量检测结果显示（见表2），各资源地上部分总黄酮含量差异较大，变异系数为32.22%，其中YN-MLP 总黄酮含量最低，仅16.66 mg·g，ZJ-WZH 总黄酮含量最高，达74.64 mg·g。相关性分析结果显示，三叶青地上部分总黄酮含量与种源地地理位置（纬度、经度及海拔）无显著相关性。总黄酮含量与公因子1呈极显著负相关（＜0.01），相关系数-0.368，即叶片增大，各资源地上部分总黄酮含量整体呈下降趋势。总黄酮含量与公因子3呈极显著正相关（＜0.01），相关系数0.375，即各资源地上部分总黄酮含量随叶柄长度增加而呈增长趋势。总黄酮含量与公因子2 无显著相关性，即其与小叶柄长度间无明显关系。

3 讨论

分析结果显示，不同种源三叶青栽培于同一生境，其叶形亦存在一定差异，其中以小叶柄长度（中叶柄长、侧叶柄长）变异系数最大（21%以上），其次是与侧生小叶片宽度相关的性状（侧叶宽、侧叶上部宽、侧叶下部宽、侧叶上宽距和侧叶下宽距），变异系数亦多大于16%，叶柄长、侧叶长和中叶片相关性状变异系数最小，多小于15%或在其左右，表明相较其他性状而言，小叶柄长度及侧生叶叶片性状对于三叶青种质资源鉴别具有更高的参考价值，且相较于茎和块根性状而言，具有直观，易于获取、实用价值更高等优势。

相关性分析结果显示，三叶青叶柄长、中叶长、中叶宽距、侧叶上宽距、侧叶柄长、叶柄比、中叶长宽比、侧叶上宽比、侧叶下宽比与种源地纬度、经度或海拔存在显著（＜0.05）或极显著（＜0.01）相关性，表明三叶青各资源叶形差异是长期适应种源地生境而产生的稳定形态学差异，例如侧叶柄长与海拔呈显著负相关（＜0.05）可能是由于海拔升高，水分减少，小叶柄朝着短缩方向发展以便于水分和养分的输送。

聚类分析结果将三叶青叶形划分为5种类型，其中，江西包含4 种类型，江西西侧的湖南和东北侧的浙江2 省包含3 种类型，江西西北侧的湖北包含2 种类型，其余省（直辖市）均仅包含1 种类型，各省（直辖市）三叶青叶形种类数量整体呈以江西为中心，向周围辐射递减的趋势，表明江西可能是三叶青各类种源的过渡区，甚至是遗传多样性的起源中心，这与尹明华等所得结论一致。此外，本研究涉及资源中，超过半数资源叶形具类型-2叶形，表明叶片较小、小叶柄较短的叶形可能更接近三叶青祖征。

本研究分析结果显示，49 个三叶青资源地上部分总黄酮含量存在较大差异，变异系数达32.22%，但总黄酮含量与种源地纬度、经度和海拔均无显著相关性，这表明导致三叶青各资源总黄酮含量差异形成的原因，可能并不仅限于经度、纬度和海拔影响，还可能与种源地光照等更为复杂多样的环境因子长期作用有关。

本研究结果显示，三叶青地上部分总黄酮含量与叶片性状公因子（公因子1）呈极显著负相关（＜0.01），与叶柄长度性状公因子（公因子3）呈极显著正相关（＜0.01），即叶片越大，三叶青地上部分总黄酮含量反而可能更少，而总叶柄增长，三叶青地上部分总黄酮含量却可能越高，由此推测，即便在叶中，黄酮类物质亦非均匀分布，且可能主要分布于叶柄或叶脉中。