桃儿七种子解剖结构及其萌发生长期形态特征

曹小路 赵巧竹 幸 华 栗孟飞

（干旱生境作物学国家重点实验室/甘肃农业大学，兰州 730070）

桃儿七（）为小檗科（Berberidaceae）桃儿七属（）多年生草本自花授粉植物，由种子萌发至开花结果需要4～6 年，主要分布于喜马拉雅邻近高海拔（2 000～4 500 m）的阴冷阴湿地区，包括中国、印度和尼泊尔等。成熟果实，又名小叶莲，为我国传统藏药，具有调经活血功效，主治血瘀经闭、难产、死胎和胎盘不下。根茎富含鬼臼毒素（podophyllotoxin），其衍生物依托泊苷、替尼泊甙和依托泊苷磷酸酯等对于化疗宫颈癌、结肠癌和乳腺癌等多种癌症具有显著疗效，已广泛应用于临床。独特的药理学活性促使其市场需求量剧增，使得其资源枯竭，已面临濒危。

为了保护和利用桃儿七资源，很多学者就植物繁殖生物学（reproductive biology）方面做了大量研究，比如，组培快繁、分根繁殖和种子繁殖。尽管通过愈伤组织诱导和胚离体培养获取完整植株以及调控外界环境促进植株生长等体系已经建立。通过根茎进行营养繁殖，可以缩短栽培周期、避免种子萌发率低和幼苗存活困难，但是根茎繁殖消耗了自身成药根产量，限制了其大规模应用。尽管自然条件下，桃儿七种子存在萌发率低和不稳定（7%～45%），但其种子数量众多（每果60～180粒种子），使得通过种子繁殖仍为桃儿七规模化繁殖的主要途径。

已有研究表明，种皮和胚乳限制、胚休眠、萌发抑制物和生理后熟等因素限制桃儿七种子萌发，通过低温层积、热水浸泡、GA 浸泡、次氯酸钠浸泡等处理可有效提高种子萌发率。为了进一步揭示桃儿七种子萌发或休眠机理，Dogra等对萌发/未萌发桃儿七种子进行蛋白质组分析，发现52 个差异表达蛋白质（酶）参与碳水化合物和氨基酸代谢、ABA/GA 信号传导以及逆境响应，对其中2个水解酶［-1，3-葡聚糖酶（-1，3-glucanase，GLC）和木葡聚糖内糖基转移酶（xyloglucan endo-transglycosylase/hydrolase，XET/H）］进行基因功能验证，发现二者均参与细胞壁疏松和胚乳软化。本课题组通过对不同萌发时期桃儿七种子进行转录组分析，发现67 个差异表达的基因直接参与种子萌发过程中的细胞壁疏松和胚乳软化、初级代谢、激素代谢、信号传导、胚根生长等。以上研究结果预示了多层胚乳和厚种皮是限制桃儿七种子萌发的主要因素。但是在种子解剖结构及其不同萌发期形态变化方面的研究报道较少。因此，本研究利用组织切片和显微技术，对不同萌发期（1、7、14、21、28 d）种子组织形态结构及其变化特征进行观察，旨在探明桃儿七种子萌发过程中的胚乳和种皮细胞学变化，为深入研究种子休眠抑制的分子机制奠定基础，从而为促进种子萌发、高效繁殖和规模化种植栽培提供理论与技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

桃儿七成熟果实于2018年7月20日采自甘肃省甘南藏族自治州卓尼县纳浪乡（海拔3 250～3 350 m；34°42′53″～34°43′40″N，102°53′12″～102°55′46″E），种子从果实中剥离后流水冲洗干净，室温自然晾干后4 ℃保存。

1.2 试验方法

取干燥饱满的种子1 000 粒，首先置于流水中冲洗表面黏液，然后在室温下浸泡萌发，每隔8 h流水冲洗1 次，分别于第1、7、14、21、28 天观察种子萌发进程、形态特征和解剖结构。

选取浸泡萌发14 d 的种子，利用体视显微镜（型号：奥林巴斯SZX16+EP50）观察种子组织形态结构并拍照。

第一，每个时期选取种子50粒，用蒸馏水冲洗干净、滤纸吸干种子表面水分，置于装有FAA 固定液（福尔马林、冰醋酸和70%乙醇体积比为1∶1∶18）的50 mL 离心管中，4 ℃下固定72 h。第二，取固定好的种子，避开胚用手术刀将其横切和纵切成小块，用70%乙醇冲洗3次，每次10 min。第三，用30%、50%、70%、85%和95%乙醇梯度脱水，各梯度间隔时间为3 h，最后用无水乙醇泡洗2 次间隔1.5 h 彻底脱水。第四，脱水后依次放入体积比为1∶2、1∶1 和2∶1 的二甲苯和无水乙醇混合溶液中浸泡，间隔2 h，然后更换至纯二甲苯溶液浸泡2次间隔1 h。第五，透明后转移至青霉素瓶中，向瓶中少量多次添加熔点54～56 ℃蜡屑，间隔8 h，用包埋剂石蜡逐步取代透明剂，直至石蜡不再熔化为止，之后更换熔融熔点54～56 ℃的纯石蜡浸泡3次，间隔6 h 换1 次蜡液，最后用熔融纯石蜡包埋。第六，根据材料的位置和方向，将蜡块修成梯形，用手动轮转切片机切片（型号：KEDEE-2258），厚度7 μm。第七，将载玻片清洗干净浸泡在无水乙醇中，12 h 后擦拭晾干，经摊片机展片，37 ℃烘片72 h。第八，将烘干的切片进行脱蜡、复水、番红固绿双重染色和透明。第九，将切片从二甲苯中取出，在组织中央滴1 滴中性树胶，盖玻片放在滴有树胶的组织切片上，慢慢下压将空气完全排除，封好的切片放入37 ℃恒温干燥箱过夜，制成永久切片。最后，利用正倒置一体荧光显微镜（型号：Echo Revolve）观察切片并拍照。

将萌发后的种子播种于含营养基质的土壤中［椰糠+草炭+发酵牛粪+珍珠岩（3∶3∶2∶2）］，一定时期后观察植株形态特征。

2 结果与分析

2.1 种子解剖结构

图1结果显示，桃儿七种子呈卵状三角形或椭圆形，隆起面为背侧，较平坦面为腹侧（见图1A），分别由种皮、胚乳和胚3 个主要部分构成（见图1B）。外种皮上的一条棱状突出为种脊，是种脐到胚珠的合点端之间隆起的脊棱线（见图1：A，C 和F）。胚由胚根、胚轴和子叶3 部分组成，胚根呈光滑圆锥形，胚轴连接胚芽与胚根（见图1：B 和D）。胚位于胚乳中央的种孔端，被珠孔胚乳、外胚乳和厚壁种皮包围（见图1：B和E）。从胚、胚乳及其各部分的连接情况看，胚轴和胚根在空间上与胚乳分离（见图1E）。种子内含有丰富的胚乳呈白色，占种子体积的绝大部分（见图1B）；珠孔胚乳呈半圆形覆盖在胚根顶端呈帽状结构，由多层小型薄壁细胞和小型厚壁细胞组成（见图1E）；胚乳组织含有大量的晶体和磷酸盐球形体的糊粉粒（见图1：C和F）。

图1 桃儿七种子的解剖结构A.种子腹面；B.种子纵切面；C.种子横切面；D.胚；E.染色后的种子纵切面；F.染色后的种子横切面；RH.种脊；TE.种皮；EM.胚；En.胚乳；RA.胚根；HY.胚轴；CO.子叶；M En.珠孔胚乳；L En.外胚乳；下同Fig.1 Anatomical structure of S.hexandrum seedsA.Ventral surface of seed；B.Longitudinal section of seed；C.Cross section of seed；D.Embryo；E.Longitudinal section of dyed seed；F.Cross section of dyed seed；RH.Raphe；TE.Testa；EM.Embryo；En.Endosperm；RA.Radicle；HY.Hypocotyle；CO.Cotyledon；M En.Micropylar endosperm；L En.Lateral endosperm；The same as below

2.2 种皮解剖结构

种子种皮包括外种皮（见图2A）和内种皮（见图2D）；外种皮表面呈棕红色，有致密规整的皱纹（见图2A），各部分的组织结构基本相同（见图2B），由外至内分别为栅状石细胞和表皮层细胞组织层（见图2C）；内种皮表面呈黄褐色，由5～6 层细胞组成，是海绵组织层结构（见图2E）。

图2 桃儿七种皮的解剖结构A.外种皮；B.4倍下外种皮；C.外种皮横切面；D.内种皮；E.内种皮横切面Fig.2 Anatomical structure of seed testa of S.hexandrumA.Episperm；B.4×magnification of episperm；C.Cross section of episperm；D.Endopleura；E.Cross section of endopleura

2.3 不同萌发期种子外部形态特征

图3结果显示，1～7 d为种子迅速吸水阶段，7～14 d 为种子吸胀阶段，14～21 d 为种子萌动阶段（胚根突破种皮的过程即为萌动、露白或破胸），21～28 d 为种子发芽阶段（当胚根的长度等于种子的长度或胚芽突破种皮并达到种子长度一半时即为发芽）。

图3 不同萌发期桃儿七种子外部形态特征Fig.3 External morphological characteristics of S.hexandrum seeds at different germination stages

2.4 不同萌发期种子解剖结构变化

图4 为种子萌发过程中纵切面的解剖结构。随着1～7 d 种子迅速吸水膨胀（见图3），胚根和胚轴部位的分生细胞开始伸长；7～14 d 胚根和胚轴扩张伸长，并出现2 片子叶在胚轴面相互分离；14～21 d 为种子萌动阶段（见图3），种胚的长度增长迅速，胚轴长度的增长较其他时期明显，胚根扩张伸长突破珠孔胚乳和厚壁种皮，子叶也扩张伸长；21～28 d为种子发芽阶段（见图3），胚根和子叶继续扩张伸长。

图4 不同萌发期桃儿七种子纵切面解剖结构Fig.4 Longitudinal anatomical structure of S.hexandrum seeds at different germination stages

2.5 种子萌发生长一定时期后形态特征

图5为萌发28 d的种子（见图3）播种后7～210 d的幼苗形态特征。由图5 可以看出，播种7 d 主根明显形成；49 d 子叶完全张开；84 d 在根茎过渡区地上部分长出第1 片真叶，地下部分长出不定根；161 d 早期子叶衰老脱落，在根茎过渡区形成新的真叶和幼芽，幼芽周围被鳞片，不定根继续增加，侧根形成；210 d地上部分形成2～4片功能真叶，地下部分形成4～6条不定根，侧根多数。

图5 桃儿七植株生长210 d内的形态特征Fig.5 Morphological characteristics of S.hexandrum plants after 210 d growth

3 讨论

种子休眠是植物适应环境变化的生物学特性，桃儿七种子休眠在面对高海拔极端环境（如低温）下起到保护作用。研究表明，种子休眠可分为两类：一类是内源性休眠（胚发育不全或种皮效应），另一类是外源性休眠。外源性休眠又分为物理体眠、化学休眠和机械体眠；物理休眠是因种子的包覆组织过于紧密或含有蜡质和胶质等，使水分和氧气不易进入；化学休眠是因种皮或胚乳中含有种子萌发的抑制剂；机械休眠是因种子胚外组织虽然透水、透气性较好，但包裹组织太坚硬，使胚芽或胚根的生长力难以穿透种壳；而许多植物种子休眠是由多种因素引起。

本研究通过对桃儿七种子及其不同萌发期解剖结构进行观察，根据致密种皮（见图2）使得干燥种子吸水周期较长（见图3）、多层胚乳包裹胚使其难以穿透胚乳（见图1 和图4）的直观结果，可以确定桃儿七种子休眠包括外源性休眠中的物理休眠和机械休眠，致密种皮和多层胚乳限制着桃儿七种子萌发。该观察结果进一步证实了Sreenivasulu等认为的多层胚乳和厚种皮是限制桃儿七种子萌发的观点。Dogra等通过对桃儿七种子萌发过程中克隆获得的参与细胞壁疏松和胚乳软化的基因和进行功能验证，发现它们的过表达可促进种子的萌发，且GA 处理显著促进其表达水平，ABA 则相反。我们通过对桃儿七种子萌发期转录组测序获得的67个差异表达基因进行功能分析，发现有25 个基因（如编码GLCs、XET/Hs和扩张蛋白等）参与细胞壁疏松和胚乳软化、16个基因（如编码淀粉酶、蔗糖合成酶和种子贮藏蛋白酶等）参与初级代谢和能量代谢、15 个基因（如编码GA、IAA 和ABA 生物合成的酶等）参与激素合成和信号传导、5个基因（如编码调节细胞分裂、细胞伸长和促进胚根生长的蛋白质等）参与胚根伸长和生长、6个转录因子（如编码参与种子萌发、下胚轴伸长和幼苗早期发育的蛋白质等）参与种子萌发；激素测定发现GA和IAA含量随萌发进程显著升高，而ABA 含量则显著下降。以上这些基因的差异表达和激素的动态变化规律，为如何快速解除桃儿七种子休眠、促进其萌发效率指明了方向。

很多报道称，自然状态下，桃儿七种子萌发需要10个月至3年的时间，由种子萌发至开花结果需要4～6年，采用“循环种植采挖模式”获取成药根和果实最快也需要5 年周期。因此，如何加快种苗繁育进程、缩短采挖周期成为桃儿七种植获取较高经济收益的关键。根据致密种皮和多层胚乳是限制桃儿七种子萌发的主要因素的研究结果，本研究进一步通过采用种子浸泡结合反复冲洗的方法（详细见1.2.1 种子浸泡萌发），促使了种子细胞壁疏松和胚乳软化、加速了种子代谢水平，实现了28 d 种子萌发，在营养基质中84 d 可形成真叶，210 d 可平均形成3 片功能真叶和5 条不定根（见图5）。这相比自然条件下2 年才能达到的生长状况，提高了3倍以上的萌发和生长效率。

目前，很多学者针对影响桃儿七种子休眠的其他因素（如胚休眠、萌发抑制物和生理后熟等）持有不同的观点，比如，有报道称胚存在休眠，而胚与胚乳进行分离培养可获得快速萌发。因此，针对桃儿七种子休眠的其他因素解析，还需要进一步深入研究与验证。