欧洲白榆UlGLK基因克隆及组织表达特异性研究

白向东 顾宸瑞 张潇月 姜 静

（东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040）

Golden2-like（GLK）转录因子，是一类植物中广泛存在的转录因子，属于MYB 转录因子大家族中的GARP 转录因子超家族。该基因主要调控植物的叶绿体发育、影响果实品质，同时也参与植物生物胁迫和非生物胁迫、植物衰老和激素信号转导等。研究表明，GLK 转录因子通过影响质体—核逆行信号进而调控植物叶绿体的代谢和发育。对水稻（）、苔藓（）和拟南芥（）的研究发现，突变体表现出浅绿色的叶片，并且叶绿素合成的前体物质积累变少。在拟南芥突变体中过量表达基因则叶色能够恢复正常绿色。AtrGLK 蛋白通过特异结合到一些天线蛋白和叶绿素合成酶相关基因启动子上，调控下游靶基因的表达。张嫚嫚等研究证明，白桦缺失突变株的叶片呈现黄色，进而从白桦中分离该基因，遗传转化白桦显示，白桦突变株导入后其叶色恢复为绿色，而白桦干扰表达转基因株系的叶色为鲜艳的黄绿色，表达量、叶片叶绿素含量均显著低于野生型白桦，获得的7 个干扰表达植株，其株高生长与野生型白桦差异不显著。同样，银中杨（）基因干扰表达株系同样其叶片的基因表达量显著降低，光合色素含量均显著低于野生型银中杨，叶色为鲜艳黄绿色。基于上述，GLK 转录因子是开展分子设计育种改良叶色的首选基因。

欧洲白榆（）为榆科（Ulmaceae）榆属（）落叶乔木，原分布于欧洲各地，近年来被广泛引种到我国北方地区栽植，生长较快、木材坚硬可作为农具、建筑和家具用材，翅果可榨油，枝、叶、树皮内含单宁，味涩苦，很少受到牲畜危害，是牧区造林的理想树种。另外，欧洲白榆的树体优美、叶片较大，遮阳性强，也是城市园林绿化的备选树种。因此欧洲白榆具有很高的经济价值和生态价值。若采用分子设计育种手段通过抑制基因的表达创制金叶白榆，则能提升该树种在园林绿化中的作用及应用前景。

RNA-seq 的兴起和对于分子生物学领域的发展具有极大的促进作用，其中mRNA 的转录组测序对一些没有参考基因组物种的基因克隆产生了很大的帮助，本研究利用转录组的数据为参考进行基因克隆，对其进行生物信息学分析，初步筛选内参基因，分析基因的组织表达特性，为研究的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

欧洲白榆的种子取自哈尔滨市道里区金河公园，将种子晾干洗净后播种在种植土壤中，种植土壤比例V（草炭土）∶V（蛭石）∶V（珍珠岩）为6∶3∶1。每隔2 d浇1次水，待14 d后选取生长健壮的苗木，采集根、茎和叶，放在液氮中急速冷冻后置于-80 ℃保存备用。

1.2 总RNA的提取及其反转录

以欧洲白榆的根、茎和叶为材料，使用植物总RNA 提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）提取RNA，分别利用0.8% 琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 10000（美国Thermo公司）检测总RNA的完整性和浓度，得到合格的欧洲白榆总RNA 后用反转录试剂盒（上海东洋纺生物科技有限公司）反转录为cDNA，保存备用。

1.3 UlGLK基因的克隆

用欧洲白榆mRNA 转录组数据建库，通过毛果杨（）的基因序列进行本地BLAST，找出欧洲白榆基因的参考序列。设计特异性引物将其命名为-F 和-R（见表1），以上述欧洲白榆的cDNA 为模板进行基因克隆。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测得到到基因片段，将符合预期的条带用胶回收试剂盒（杭州博日科技有限公司）回收，回收后的条带与pGEMTeasy Vector 连接，转入DH5大肠感受态，筛选阳性克隆提取质粒后测序。

表1 本研究用引物序列Table 1 The sequences of primers used in this study

1.4 UlGLK基因的生物信息学分析

在NCBI 网站上对基因的保守结构域进行预测，利用BLAST 对其进行同源性比较。通过MEGA7 对得到的碱基序列进行翻译获得氨基酸序列，对同源性较高的序列进行进化树的构建。使用ExPASy 对得到的氨基酸序列分析其分子质量、原子总数、分子式等指标UlGLK 蛋白的亲/疏水性和是否含有信号肽。使用ProtComp 9.0 软件进行亚细胞定位分析，采用SOPMA 软件预测UlGLK 蛋白的二级结构，Swiss-model 软件预测该蛋白的三级结构。

1.5 内参基因的筛选

用欧洲白榆mRNA 转录组数据建库，通过毛果杨的、、基因序列进行本地BLAST 找出欧洲白榆、、基因的参考序列。分别设计相应的引物（见表1）进行RT-PCR验证。

1.6 UlGLK基因的组织表达特性

将上述欧洲白榆根、茎和叶的cDNA 稀释10倍用于qRT-PCR 模板，以为内参基因，引物序列见表1，进行qRT-PCR 分析，PCR 反应体系为：2×SYBR Green Realtime PCR Master mix 10.0 μL（日本Toyobo 公司）、模板2.5 μL、上游引物和下游引物（10 μmol·L）各0.5 μL、用去离子水补足体积20.0 μL。反应程序：94 ℃30 s；94 ℃12 s，54 ℃30 s，72 ℃30s，循环45 次；80.0 ℃读板1 s，收集荧光，绘制熔解曲线，温度由55 ℃开始至99 ℃终止。利用DNA Engine Opticon2 实时定量PCR 仪（美国MJ Research 公司）完成扩增过程。最后得到的数据用2计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 UlGLK基因的的克隆

以欧洲白榆叶片的cDNA为模板，利用特异性引物-F 和-R 对其进行PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳检测显示，在1 400 bp处有扩增谱带（见图1），将谱带回收与pGEM-Teasy Vector 连接，转化大肠杆菌后送往擎科生物科技有限公司（哈尔滨）测序。测序结果与转录组参考序列比对长度一致，均为1 353 bp，没有gap 区域，序列相似度为99.26%，对比分数为6 675.00。

图1 UlGLK基因片段PCR扩增电泳图谱M.DL2000 DNA Maker ；1.对照；2.UlGLK基因扩增产物Fig.1 PCR amplification of UlGLK geneM. DL2000 DNA Maker；1. Control；2. Amplification products ofULGLK gene

2.2 UlGLK序列分析

通过在线网站预测基因编码的蛋白发现，蛋白的相对分子质量111 144.04、分子式CHNOS、原子总数14 082、理论等电点5.00、稳定系数42.51、脂肪系数27.72。蛋白具有GOLDEN2-LIKE 类转录因子的保守结构域。蛋白为亲水性蛋白，没有信号肽区域为非转膜运输蛋白（见图2）。ProtComp 9.0软件预测其定位于细胞核。二级结构和三级结构如图所示（见图3）。

图2 UlGLK的亲/疏水性和跨膜结构预测Fig.2 Prediction of hydrophilicity/hydrophobicity and transmembrane structure of UlGLK

图3 UlGLK的结构分析Fig.3 Structure analysis of UlGLK

2.3 UlGLK氨基酸序列同源性比较

将欧洲白榆的的氨基酸序列在NCBI网站上比对后发现欧洲白榆的GLK 蛋白与川桑（）、大麻（）同源性最高，达到85%以上，与其他物种的GLK氨基酸序列的相似性也都在80%以上，其中和已证明的拟南芥、银中杨、毛果杨的GLK 氨基酸序列的同源性也很高（见图4～5），而且氨基酸序列也具有MYB转录因子家族的与DNA结合的结构域和一个保守的GCTbox保守结构域。基本可以说明基因在欧洲白榆体内的功能与前述物种相似。

图4 UlGLK序列比对结果UlGLK.欧洲白榆；PeGLK.胡杨；PtrGLK.毛果杨；PaGLK.银中杨；MnGLK1.川桑；CsGLK1大麻；AtrGLK1/2.拟南芥Fig.4 Sequence alignment results of ULGLKUlGLK.Ulmus laevis；PeGLK.Populus euphratica；PtrGLK.Populus trichocarpa；PaGLK.Populus alba×P.berolinensis；MnGLK1.Morus notabilis；Cs-GLK1.Cannabis sativa；AtrGLK1/2.Arabidopsis thaliana

图5 UlGLK进化树Fig.5 Phylogenetic tree analysis of UlGLK

2.4 RT-PCR分析内参基因的筛选

榆属植物在分子生物学方面的研究报道较少，迄今为止尚无RT-PCR 内参基因的相关报道。因此，以白榆根、茎和叶组织cDNA 为模板，采用RT-PCR 技术扩增、、内参基因，2%凝胶电泳（见图6）。基因在根、茎和叶3种组织中的扩增亮度基本一致，且扩增强度也高于其他2 种内参基因，说明基因在根、茎和叶3 种组织中表达量基本一致，适合用于后续的RT-PCR分析。

图6 Ubiquitin、Actin、Tubulin在欧洲白榆半定量中的分析1～3.Ubiquitin 在根、茎、叶中的表达量；4～6.Actin 在根、茎、叶中的表达量；7～9.Tubulin在根、茎、叶中的表达量Fig.6 Analysis of Ubiquitin，Actin and Tubulin in semi quantitative analysis of U.laevis1-3.Expression levels of Ubiquitin in roots，stems and leaves；4-6.Expression levels of Actin in roots，stems and leaves；7-9.Expression levels of Tubulin in roots，stems and leaves

2.5 UlGLK组织表达特异性的分析

为了研究欧洲白榆基因在转录水平上的组织表达特异性，分别选取欧洲白榆的根、茎和叶的cDNA 为模板，以ubiquitin 为内参基因进行实时荧光定量PCR，结果表明欧洲白榆基因在叶中的相对表达量最高，是根中的12倍左右，其次是茎，表达量最低的是根（见图7）。

图7 不同组织部位的相对表达量不同小写字母代表不同组织间差异显著（P＜0.05）Fig.7 Expression of UlGLK in different tissuesDifferent lowercase letters represent significant differences between different tissues（P＜0.05）

3 讨论

由于mRNA 转录组测序技术的兴起和发展，使得大多数没有参考基因组植物的基因克隆情况得到了很大地发展。本试验基于对欧洲白榆mRNA转录组的测序，准确地克隆出了基因的序列，基因的全长为1 353 bp，一共编码450 个 氨 基 酸。具 有GOLDEN2-LIKE 类 转录因子的保守结构域，同GLK 基因功能已证明的物种的序列具有很高的同源性，另外在叶中的表达量显著高于植株的其他组织和器官，这一结果与前人的研究相同。

RT-PCR 和qRT-PCR 技术对于基因在转录水平上表达量的研究至关重要，在基因相对表达研究中，内参基因的选择十分重要，只有选择在不同组织、不同部位和不同发育阶段表达量基本不变的基因作为内参基因，才能精准确定目的基因的表达变化。榆科榆属植物在我国分布很广，具有重要的利用价值，但是在分子生物学领域研究报道较少。本实验对欧洲白榆的内参基因进行了初步筛选，发现ubiquitin 基因在根、茎和叶3 种组织中表达量基本一致，且相较于其他内参基因表达量高，研究结果，为后续榆树的基因表达研究提供指导。

GLK 转录因子属于GARP 转录因子超家族的成员，该基因在原始的开花植物中是单个基因，后来在某些物种中基因进行了复制，通过一对基因共同来调控叶绿体的发育，在欧洲白榆转录组中仅发现一条GLK 基因。通过上述研究可以为欧洲白榆的分子育种及榆属植物基因克隆的研究奠定良好的基础。