GPRC5A对LPS诱导的支气管上皮16HBE细胞损伤的影响及机制

王静， 康媛洁， 刘翠翠， 石晓岚， 马彩玲

支气管哮喘(bronchial asthma, BA)简称为哮喘，是一种以气道炎症、气道高反应性、黏液高分泌、黏液水肿和气道重塑为主要特征的异质性炎症性疾病，是最常见的慢性呼吸道疾病之一[1]。支气管上皮细胞(bronchial epithelial cells, EBCs)作为呼吸道防御的第一道防线，可通过合成和释放细胞因子及趋化因子等维持气道微环境的稳态[2]。近年来的研究[2-4]发现，EBCs的损害、脱落能够导致气道炎症和气道重塑，而改善EBCs损伤被认为是治疗BA和其他高反应性气道疾病的重要策略。脂多糖(lipo polysaccharides, LPS)是构成革兰氏阴性细菌细胞壁的重要成员，有诱导机体炎症反应的作用，常被作为EBCs损伤体外研究的刺激源[5-6]。G蛋白偶联受体家族C组5型(G protein coupled receptor family C group 5 member A, GPRC5A)是G蛋白偶联受体家族中的一员，在调节小鼠肺损伤过程中发挥重要作用[7]。文献[8]报道，以GPRC5A为靶标的药物Tretinoin对BA有一定的治疗作用，但GPRC5A在BA中的具体功能机制尚未明确。笔者拟通过研究LPS刺激下EBCs中GPRC5A的表达和GPRC5A过表达后对EBCs的细胞活力、细胞凋亡、炎症反应及气道黏蛋白分泌的影响，探讨GPRC5A对BA的影响和可能的作用机制。

1 对象与方法

1.1 对象 收集2018年2月—2020年1月西安市儿童医院呼吸哮喘中心招募的42组重度BA患者，年龄(41.02±8.14)岁(29～58岁)，男性17例，女性25例。选取同期28组健康受试者作为对照组，年龄(39.71±9.40)岁(27～61岁)，男性15例，女性13例。参与者未接受全身类固醇或者激素治疗。根据GINA指南[9]，BA诊断基于反复发作的喘息、呼吸困难、咳嗽和痰液产生等。本研究通过西安市儿童医院伦理委员会批准(伦理号20220065)，参与者均签署书面知情同意书。

1.2 材料 正常人EBCs株16HBE(中国科学院上海细胞库)；胎牛血清、RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)；LPS(E.coliO55:B5)、MTT 试剂和脂质体2000(美国Sigma公司)；胰蛋白酶、DMSO、青霉素-链霉素溶液和PCR引物(中国上海生工生物公司)；pcDNA3.1载体质粒、Lipofectamine 3000试剂(美国Invitrogen公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、裂解液和凋亡检测试剂盒(中国上海碧云天生物公司)；RNeasy mini试剂盒(德国Qiagen公司)；GoScriptTM逆转录试剂盒(美国Promega公司)；SYBR R Premix Ex TaqTM试剂(日本TaKaRa公司)；PVDF 膜和发光显影液(美国Millipore公司)；NF-κB p65抗体(1∶800, GTX00947, 美国Gene Tex公司)；κB抑制因子抗体(inhibitory kappa B alpha, IκBα)(1∶1 000, A1187, 美国ABclonal公司)；GPRC5A抗体(1∶1 000, ab155557)；Bax抗体(1∶500, ab53154)；Bcl-2抗体(1∶500, ab196495)；Cleaved caspase-3(1∶1 000, ab2302)；GAPDH 抗体(1∶1 000, ab9485)和辣根过氧化酶标记的二抗(1∶10 000, ab205718)(均为美国Abcam公司)。

1.3 方法

1.3.1 数据分析 从基因表达组学数据库(gene expression omnibus, GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)获得转录组基因芯片的数据集GSE64913。该数据集共进行17位重度BA患者和23位健康受试者外周气道上皮组织的收集和基因表达分析。

1.3.2 组织样本获取及分析 通过支气管上皮刷分别采集重度BA患者和对照组的气道上皮组织，-80 ℃下冻存。

1.3.3 EBCs损伤模型的建立及分组 用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养EBCs株16HBE，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中进行常规培养，于细胞汇合至70%～80%时传代。首先进行LPS诱导EBCs损伤模型的剂量及时间梯度试验，以不同质量浓度的LPS(10、25、50、100 mg/mL)刺激状态良好的16HBE细胞，处理不同时间(6、12、24、48 h)，MTT法测定细胞活力以确定用于进一步实验的最佳非细胞毒性剂量及处理时间。将细胞分为4组，每组3个复孔：Control组(未处理)、LPS 组(50 mg/L LPS处理24 h)、LPS+pcDNA组(转染pcDNA后经50 mg/L LPS处理24 h)和LPS+pcDNA-GPRC5A组(转染pcDNA-GPRC5A后经50 mg/L LPS处理24 h)。其中pcDNA为pcDNA3.1质粒，作为空白载体对照；pcDNA-GPRC5A过表达质粒是将人源GPRC5A基因插入pcDNA3.1载体中构建而成。使用Lipofectamine 3000试剂进行细胞转染，转染48 h后进行后续实验的检测。

1.3.4 实时荧光定量聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测GPRC5A、IL-6和TNF-α mRNA的表达 利用RNeasy mini试剂盒从细胞裂解液中提取总RNA，采用GoScriptTM逆转录系统获得cDNA。根据SYBR R Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行PCR定量检测，利用GAPDH为内参。使用引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.5 Western-blot法检测GPRC5A、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、MUC5AC、NF-κB p65、IκBα的蛋白表达 将处理结束后的16HBE细胞裂解于含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液，于冰上裂解10 min，4 ℃×12 000 r/min离心30 min，上清液即为总蛋白。利用BCA蛋白定量试剂盒检测获得的总蛋白浓度后，利用SDS-PAGE凝胶进行电泳，将目的蛋白转至PVDF膜上，用含5%脱脂乳Tris缓冲液进行封闭2 h，分别加入兔抗 GPRC5A、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、MUC5AC、IκBα、NF-κB p65、GAPDH，4 ℃过夜，再加入辣根过氧化酶标记的二抗，室温孵育2 h，利用ECL发光液进行显影，蛋白条带灰度值由Image J软件进行定量。

1.3.6 MTT检测16HBE细胞活力 收集处理后的16HBE细胞，以适当密度接种至96孔细胞板上。每组设5个平行孔。于培养箱中培养24 h后，培养结束后弃培养液，添加20 μL质量浓度为5 mg/mL 的MTT溶液。孵育4 h后，加入DMSO溶液震荡反应至结晶溶解。采用酶标仪在λ=490 nm处检测16HBE细胞的吸光度(optical density, OD)，其变化趋势与细胞活力变化一致，可以表征细胞活力[10]。

1.3.7 流式细胞术检测16HBE细胞的凋亡 收集处理结束后的16HBE细胞，用500 μL的binding buffer悬浮细胞，加入5 μL的annexin V FITC避光反应20 min，加入5 μL的PI避光反应20 min，用0.048 mm铜筛过滤，1 h内采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。每个样品做3次平行实验，实验重复2次。

2 结 果

2.1 GPRC5A在LPS活化的16HBE细胞和气道上皮组织中表达 BA患者组织中GPRC5 mRNA的表达水平高于对照组(P<0.05，图1A)。在气道上皮组织的样本数据集GSE64913中，患有严重BA的人群中GPRC5A mRNA的表达量低于对照组，差别有统计学意义(P<0.05，图1B)。与Control组细胞比较，LPS处理呈剂量和时间依赖性降低16HBE细胞活力，其中50 mg/mL的LPS处理16HBE细胞24 h可使细胞活力下降约50%(P<0.05，图1C～D)，因此，该处理条件下的细胞可作为后续实验的体外BA模型。通过qRT-PCR和Western-blot检测发现，与Control组比较，LPS处理组的GPRC5A mRNA和蛋白的表达量均降低，差别有统计学意义(P<0.05，图1E～F)。

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；BA：支气管哮喘；GPRC5A：G蛋白偶联受体家族C组5型；LPS：脂多糖。A、B图中G1组：重度BA气道上皮组织(n=42)；G2组：健康受试气道上皮组织(n=28)。与G2组比较，#：P<0.05。C图中Control组：未处理的16HBE细胞；不同浓度LPS(10、25、50、100 mg/mL)处理的16HBE细胞。与Control组比较，#：P<0.05；与25 mg/mL LPS组比较，$：P<0.05；与50 mg/mL LPS组比较，&：P<0.05。D图中Control组：未处理的16HBE细胞；50 mg/mL LPS处理16HBE细胞不同时间(6、12、24、48 h)。与Control组比较，#：P<0.05；与LPS 6 h处理组比较，$：P<0.05；与LPS 24 h处理比较，&：P<0.05。E、F图Control组：未处理的16HBE细胞；LPS组：50 mg/L LPS处理24 h的16HBE细胞；与Control组比较，#：P<0.05。图1 GPRC5A在LPS活化的16HBE细胞和气道上皮组织中的表达Fig.1 Expression of GPRC5A in LPS-induced 16HBE cells and airway epithelial tissues

2.2 GPRC5A 促进16HBE细胞活力并抑制凋亡 qRT-PCR和Western-blot检测发现，与Control组及对照组比较，pcDNA-GPRC5A转染组中GPRC5A的mRNA和蛋白表达水平提高，且差别有统计学意义(P<0.05，图2A～B)。与Control组比较，LPS处理组的细胞活力降低，而细胞凋亡率显著升高，Bax和Caspase-3蛋白表达显著增加，Bcl-2蛋白表达显著下降，且差别均有统计学意义(P<0.05，图2C～F)。此外，与LPS处理组比较，pcDNA-GPRC5A转染组的细胞活力升高，细胞凋亡率降低，Bax和Caspase-3蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达上调，且差别均有统计学意义(P<0.05)。

GPRC5A：G蛋白偶联受体家族C组5型；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；LPS：脂多糖。A～F图中Control组：未处理的16HBE细胞；pcDNA组：转染pcDNA3.1空白载体质粒的16HBE细胞；pcDNA-GPRC5A组：转染pcDNA-GPRC5A质粒的16HBE细胞；LPS Control组：50 mg/L LPS处理24 h的16HBE细胞；LPS+pcDNA组：50 mg/L LPS处理24 h后，转染pcDNA3.1空白载体质粒的16HBE细胞；LPS+pcDNA-GPRC5A组：50 mg/L LPS处理24 h后，转染pcDNA-GPRC5A质粒的16HBE细胞。与Control组比较，#：P<0.05；与LPS+pcDNA组比较，$：P<0.05。图2 GPRC5A过表达对LPS活化的16HBE细胞活力与凋亡的影响Fig.2 Effects of GPRC5A overexpression on cell viability and apoptosis in LPS-induced 16HBE cells

2.3 GPRC5A抑制LPS活化的炎症因子、气道黏蛋白的表达 LPS处理组的TNF-α与IL-6 mRNA表达水平高于Control组，差别有统计学意义(P<0.05)；而LPS处理组在过表达GPRC5A后，TNF-α 与IL-6 mRNA表达水平降低，差别有统计学意义(P<0.05，图3A～B)。LPS处理组的气道黏蛋白MUC5AC蛋白表达量高于Control组，在过表达GPRC5A后，MUC5AC蛋白表达量又下降，差别均有统计学意义(P<0.05，图3C～D)。

2.4 GPRC5A抑制LPS活化的NF-κB信号通路相关蛋白的表达 Western-blot检测结果可见，与Control组比较，LPS处理组NF-κB信号通路相关蛋白IκBα与NF-κB p65的蛋白表达水平升高，且差别均有统计学意义(P<0.05)。LPS处理组在转染pcDNA-GPRC5A后，IκBα与NF-κB p65的蛋白表达水平降低，差别有统计学意义(P<0.05，图4)。

TNF-α：肿瘤坏死因子-α；LPS：脂多糖；GPRC5A：G蛋白偶联受体家族C组5型；IL-6：白细胞介素-6；MUC5AC：黏蛋白5AC；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶。Control组：未处理的16HBE细胞；LPS Control组：50 mg/L LPS处理24 h的16HBE细胞；LPS+pcDNA组：50 mg/L LPS处理24 h后，转染pcDNA3.1空白载体质粒的16HBE细胞；LPS+pcDNA-GPRC5A组：50 mg/L LPS处理24 h 后，转染pcDNA-GPRC5A质粒的16HBE细胞。与Control组比较，#：P<0.05；与LPS+pcDNA组比较，$：P<0.05。图3 GPRC5A过表达对LPS活化的16HBE细胞炎症和气道黏蛋白MUC5AC表达的影响Fig.3 Effects of GPRC5A overexpression on inflammation and MUC5AC expression in LPS-induced 16HBE cells

LPS：脂多糖；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；IκBα：人核因子κB(NF-κB)抑制蛋白α；NF-κB p65：NF-κB的一个亚基，由p65-RelA和RelB组成；GPRC5A：G蛋白偶联受体家族C组5型。Control组：未处理的16HBE细胞；LPS Control组：50 mg/L LPS处理24 h的16HBE细胞；LPS + pcDNA组：50 mg/L LPS处理24 h后，转染pcDNA3.1空白载体质粒的16HBE细胞；LPS+pcDNA-GPRC5A组：50 mg/L LPS处理24 h后，转染pcDNA-GPRC5A质粒的16HBE细胞。与Control组比较，#：P<0.05；与LPS+pcDNA组比较，$：P<0.05。图4 GPRC5A过表达对LPS活化的16HBE细胞NF-κB通路相关蛋白IκBα与NF-κB p65表达的影响Fig.4 Effects of GPRC5A overexpression on the expression of NF-κB pathway related proteins IκBα and NF-κB p65 in LPS-induced 16HBE cells

3 讨 论

G蛋白偶联受体是一类含有7个跨膜结构域的受体，广泛存在于真核生物体内，多以二聚体的形式与胞内G蛋白相互结合来传递信号，参与调节细胞的重要生理活动[11]。GPRC5A是G蛋白偶联受体家族的一个成员，最初是在人类口腔鳞癌细胞株UMSCC-22B 中发现，可被维甲酸(retinoic acid，RA)诱导和调节，因此，又称为RA诱导基因1(retinoic acid inducible gene 1,RAIG1)[12]，其主要在支气管肺泡上皮中表达，对于肺稳态的调节有重要意义。近年来研究[13-14]发现，与GPRC5A在小鼠和人肺组织中的特异性表达比较，其在肺癌组织中的表达水平显著下调，并且GPRC5A敲除小鼠在 1～2 a中会自发肺癌，表明GPRC5A可能是一种肺癌抑癌基因。进一步的研究[15]报道，在接受LPS刺激后，GPRC5A敲除小鼠肺组织中产生的炎症因子和趋化因子水平显著高于野生型小鼠，由此说明GPRC5A敲除使小鼠肺组织对LPS刺激更敏感。本研究结果表明，在成功构建的LPS诱导的16HBE EBCs损伤模型中，GPRC5A的表达明显降低，提示GPRC5A可能参与调控BA的进展。

值得注意的是，LPS可与白细胞分化抗原14(cluster of differentiation 14, CD14)/Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)/骨髓分化蛋白2(myeloid differentiation protein 2, MD2)复合物模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)结合，调节IκBα的稳定性进而影响NF-κB的转位及炎性因子的释放[16-17]。GPRC5A基因敲除通过激活在小鼠肺上皮细胞中的NF-κB信号通路，从而促进了肺部炎症和肿瘤发生，而抑制NF-κB信号通路能够逆转上述改变，提示GPRC5A基因在疾病中的作用与NF-κB信号通路有关[7,18]。NF-κB信号通路通过调节一些细胞因子的表达，参与细胞的炎症反应、肿瘤发生、免疫反应、细胞凋亡等多种生物学进程[19]。大量临床数据显示，在BA患者痰液中的嗜酸性粒细胞、EBCs、肺泡巨噬细胞等细胞中均存在NF-κB信号通路的激活现象，并且NF-κB调控的炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)、趋化因子与黏附因子(ICAM-1、VCAM-1)及炎性类酶(iNOS, COX-2)等均在BA疾病发生过程中起着主要作用[16,19-22]。此外，气道黏蛋白MUC5AC能促进炎症细胞浸润诱导BA的发生[23]。有趣的是，在体内外的研究[22, 24-25]中均发现，抑制NF-κB信号通路的激活，可以调节EBCs中炎症因子和MUC5AC的分泌，并对细胞的增殖及凋亡产生影响。本研究发现，在16HBE细胞中，过表达GPRC5A可通过下调NF-κB信号通路相关蛋白(IκBα与NF-κB p65)的表达，抑制LPS诱导的炎症因子TNF-α、IL-6以及气道黏蛋白MUC5AC分泌，进而促进细胞活力，抑制细胞凋亡。由此可见，GPRC5A过表达对LPS诱导的16HBE细胞损伤有调控作用。

综上所述，本研究阐明了GPRC5A在EBCs损伤的炎症反应和凋亡中的作用，并发现其机制与NF-κB信号通路有关，为GPRC5A在BA中的功能研究及机制探索提供了理论基础，同时为BA疾病的治疗中提供潜在靶点。后续研究中应进一步分析GPRC5A对BA病理进展中的气道高反应性、气道重塑及黏液栓形成的影响；从动物水平验证GPRC5A在BA发生、发展中的作用。