大球盖菇种质资源遗传多样性
2022-10-11周智高何华奇蒋圣娟
周智高， 何华奇*， 蒋圣娟
(1.安徽科技学院 农学院，安徽 凤阳 233100；2.安徽科技学院 生命与健康科学学院，安徽 凤阳 233100)
大球盖菇(Strophariarugoso-annulataFarlow apud Murrill),又名酒红大球盖菇、皱环球盖菇、皱球盖菇、裴氏球盖菇、裴氏假黑伞等[1],隶属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、球盖菇科、球盖菇属。该菇1922年首次被发现并命名于美国,其后欧洲各国、日本、中国也相继发现其分布[2]。大球盖菇营养丰富、色泽艳丽,菇味清香柔和、菇质嫩脆、适口性好[3-4]。国内学者对大球盖菇的生物学特性、制种及栽培技术进行了研究[5-6]。大球盖菇种质资源十分丰富[7-8],广泛栽培的品种之间有何遗传关系尚不清楚,本研究利用同工酶和RAPD技术[9-11],研究大球盖菇菌株的亲缘关系,以期为大球盖菇的栽培和育种工作提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
供试大球盖菇(Strophariarugoso-annulata)菌株编号及来源见表1，由上海市农业科学院食用菌研究所菌种保藏中心提供。
表1 供试菌株编号及来源Table 1 Numbers and sources of teseted isolates of Stropharia rugoso-annulata
1.2 供试培养基
完全培养基(CYM培养基):20 g葡萄糖、2 g蛋白胨、2 g酵母膏、0.5 g MgSO4·7H2O；0.46 g KH2PO4、1 g K2HPO4、1 000 mL蒸馏水[12]。
1.3 大球盖菇酯酶同工酶的提取和电泳
供试菌株接种于CYM培养基,25 ℃培养15 d。酯酶同工酶提取方法及聚丙烯酰胺凝胶电泳均按潘迎捷等[9]方法进行,分离胶浓度为7.5%,浓缩胶浓度为4%,交联度为2.7%。
1.3.1 酯酶和过氧化物同工酶的提取 将大球盖菇菌种接种至CYM液体培养基中,25 ℃培养15 d。收集菌丝体冷冻干燥24 h。取1 mg干燥菌丝体研磨成粉末,加1.5 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH6.4),10 000 r/min,4 ℃下离心20 min,上清液4 ℃下保存备用。
1.3.2 聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳 将样品与凝胶上样缓冲液(40%蔗糖,0.25%溴酚蓝)按5∶1混合,取35 μL 上样于加样孔中,采用浓缩胶电泳电压70 V,分离胶电泳电压90 V,进行电泳。
1.3.3 酯酶同工酶染色液配制 160 mg醋酸-1-萘酯、160 mg醋酸-2-萘酯,溶解于8 mL丙酮后,加入320 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.4),然后加入160 mg固蓝RR盐,搅拌溶解,过滤。
1.3.4 过氧化物同工酶染色液配制 A液：1.2 g联苯胺用9 mL冰醋酸溶解(80 ℃)后,加51 mL蒸馏水;B液：4%氯化铵;C液：5% EDTA;D液：0.3%过氧化氢。按v(A)∶v(B)∶v(C)∶v(D)∶v(水)=30∶30∶30∶30∶240混匀。
1.3.5 聚丙烯酰胺凝胶同工酶染色 取下凝胶,置于现配制的同工酶染色液中,37 ℃染色20 min至同工酶条带完全显色。将凝胶用蒸馏水洗涤,除尽染色液,用7%冰乙酸固定后，VDS观察并拍照。
1.4 RAPD 扩增
DNA提取参考谭琦等[13-14]的方法。RAPD反应采用20种上海生物工程中心合成的随机引物,即S12、S8、S10、S12-S19、S42-S44、S47、S59、S60和OPA02、OPA03、OPA05。
PCR反应程序为,92 ℃变性5 min,然后92 ℃变性1 min,35 ℃复性1 min,72 ℃延伸2 min,重复此循环45次。最后72 ℃补平5 min。反应结束后,反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测,观察电泳结果并拍照。
1.5 聚类分析
统计聚丙烯酰胺凝胶电泳中的同工酶条带和琼脂糖凝胶电泳中的DNA条带,用NTSYS软件中的Simqual程序计算大球盖菇不同菌株间相似系数,然后用平均连锁聚类分析方法(UPGMA)进行聚类分析,构建遗传相关聚类图谱。
2 结果与分析
2.1 酯酶同工酶分析
2.1.1 酯酶同工酶酶谱 10株不同来源大球盖菇菌株的酯酶同工酶酶谱中共存在18种迁移率不同的酶带,其相对迁移率在0.15～0.91之间,酶带总数为44条,10株大球盖菇菌株酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱如图1所示。
图1 10株大球盖菇菌株酯酶同工酶酶谱Fig.1 Schematic map on esterase isoenzyme of Stropharia rugoso-annulata isolates
2.1.2 酶谱的相似系数和聚类分析 根据大球盖菇酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳条带结果,用NTSYS Simqual程序计算出不同菌株的相似系数,组成相似系数矩阵,用UPGMA聚类法,将10株菌株之间的相似系数进行聚类,构建树状聚类图,如图2所示。
图2 大球盖菇菌株酯酶同工酶酶谱树状聚类图Fig.2 Dendrogram of cluster analysis based on similarity coefficient of Stropharia rugoso-annulata isolates
从10株菌株之间的相似系数及其树状聚类图可以看出，10株菌株聚成了不同的类,最大的2类之间的相似系数只有0.009 6,这说明菌株之间的遗传差异很大;St4和St5间的相似系数为1.000 0,来源都是美国,可能是同一菌株,编号不同或本来是同一菌株,后流传到不同的地方;St1、St2、St4、St5聚为一类,相似系数在0.500 0以上,虽然St1来源于浙江松阳,但其与美国的几个菌株相似系数较大,说明它与美国的菌株具有一定的同源性。
2.2 大球盖菇菌株过氧化物同工酶分析
不同大球盖菇菌株过氧化物同工酶电泳图谱中总共出现18条酶带,电泳图谱见图3。St4、St7、St8、St9、St10没有酶带出现,重复试验,结果一致。这说明大球盖菇的过氧化物同工酶活力不高,酶带单调,不适宜用做检测遗传多样性的生化标记。
图3 10株大球盖菇菌株过氧化物同工酶酶谱Fig.3 Schematic map on peroxidese isoenzyme patterns of 10 isolates in Stropharia rugoso-annulata
2.3 RAPD分析
2.3.1 RAPD结果统计 利用20个随机引物对10株大球盖菇进行了RAPD分析,结果显示,有16个随机引物的扩增效果较好,条带丰富,重复性好,这16个引物分别可扩增出8～21个条带,共扩增出241条条带,平均每个引物有15.1个DNA扩增片段,片段大小在200～4 000 bp之间,引物S59、S60扩增产物图谱见图4～5。
图4 随机引物S59扩增产物图谱Fig.4 Map of results amplified by primer S43
图5 随机引物S60扩增产物图谱Fig.5 Map of results amplified by primer S60
2.3.2 10株大球盖菇的相似系数和聚类分析 根据10株菌株以16种引物扩增的DNA条带结果,用NTSYS软件中的Simqual程序计算出不同菌株间的相似系数,组成相似系数矩阵,用UPGMA聚类法,将10株菌株之间的相似系数进行聚类,构建树状类聚图,如图6所示。
图6 10株大球盖菇菌株DNA相似系数的树状聚类图Fig.6 Dendrogram of cluster analysis based on DNA similarity coefficient of 10 isolates
从10个菌株之间的相似系数及树状聚类图可以看出，菌株St2、St4和St5的相似系数在0.800 0以上,其亲缘关系较近,St9、St10、St11之间及与其他菌株之间相似系数均在0.500 0以下,说明它们之间的亲缘关系较远。本结果与同工酶结果基本一致,说明菌株之间具有较大的遗传多样性。
3 结论与讨论
10个菌株遗传多样性的RAPD分析与酯酶同工酶的结果基本相同,进一步证明10株大球盖菇菌株之间存在着丰富的遗传多样性,只是在菌株之间的相似系数上,同工酶的分析结果大体上都低于RAPD的分析结果。由此看来,10个菌株在同工酶上表现出更大的遗传多样性。除St4和St5外,其他菌株间的遗传相似系数最大只在0.5左右,而St7和St8聚成的一类与其他菌株所成一类间的遗传相似系数只有0.009 6。大球盖菇菌株间的过氧化物酶酶谱由于酶带较少,不宜用做检测遗传多样性的生化标记。
RAPD结果中,St1、St2、St4、St5相似系数在0.500 0以上,与酯酶同工酶相同,说明核酸水平和蛋白质水平表现出一致性。但St6和St10在核酸水平和蛋白质水平上有一定的差异,可能是由于在转录和翻译水平上存在复杂的表达调控。
通过聚类分析发现,同工酶酶谱显示大球盖菇菌株间最小的相似系数为0.009 6,而RAPD扩增条带谱显示大球盖菇菌株间最小的相似系数也只有0.195 3,说明大球盖菇菌株之间遗传差异性十分明显,育种工作者可根据菌株间的亲缘关系选择亲本进行杂交,从而容易获得性状超越双亲的新菌株,为大球盖菇的生长提供优良品种。
就目前来看,很多高校都建有食用菌种质资源库,但是资源库中的种类繁多,存在很多“同物异名”的现象,同工酶作为基因编码的产物,由于模板作用,酶蛋白质中多肽链上的氨基酸顺序(通过RNA)直接反应了DNA链上碱基对的顺序,其变化能代表DNA分子水平上的变化。酯酶同工酶在食用菌个体内具有较高的相对稳定性,酶谱资料可以作为鉴定物种以及研究分类、进化与变异的重要指标。因此,同工酶分析被广泛应用于各种大型真菌的分类鉴定[15]。在一定范围内,双亲间的亲缘关系、生态类型和生理特征差异越大,双亲间相对性状的优缺点越能彼此互补,杂交优势就越明显,因此,杂交亲本间亲缘关系的远近是育种成败的关键[16]。
