SARS-CoV-2中和性纳米抗体的原核表达及中和活性检测

王海宁，刘兴健，高新桃，李轶女，沈兴家，张志芳，易咏竹*

1.江苏科技大学生物技术学院，江苏省蚕桑生物学与生物技术重点实验室，江苏 镇江212100；

2.中国农业科学院蚕业研究所，农业农村部蚕桑遗传改良重点实验室，江苏 镇江212100；

3.中国农业科学院生物技术研究所，北京100081

近年来新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）在全球范围的流行给世界人民的生命安全带来了严重威胁，同时也严重阻碍世界经济发展。严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2，SARS-CoV-2）是引起COVID-19的病原体，其刺突蛋白S蛋白（spike protein，S）的受体结合结构域（receptor binding domain，RBD）与宿主细胞膜上的血管紧张素转化酶Ⅱ（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）结合致使病毒侵入机体致病［1］。

中和性抗体作为制药行业中规模最大、增长最快的领域，已成为COVID-19预防和治疗的有效手段［2-5］，其中小分子抗体具有生产成本低、易于重组表达等优势［6-8］。作为小分子抗体的一员，纳米抗体取自骆驼科动物体内重链抗体的可变区部分（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH），长度和宽度只有纳米级别，是已知具有抗原结合能力的最小抗体，可以特异性结合新冠病毒S蛋白的受体结合域RBD，阻止其与细胞膜受体ACE2结合，进而影响病毒进入细胞。它与一般抗体相比除了具有分子量小、渗透性强、免疫原性弱、亲和力高等优势，在一些条件下具有更强的稳定性，较简单的结构也使其易于重组表达，因此在COVID-19的防治方面具有潜在的应用前景［9-11］。

Huo等［12］将 纯 化 后 的SARS-CoV-2 S蛋 白RBD片段注射到免疫羊驼体内后获得纳米抗体文库，通过噬菌体展示技术淘选出多个针对RBD蛋白的纳米抗体，将亲和力最强的纳米抗体命名为H11。H11随机突变后获得H11-D4、H11-H4，实验证明H11-D4和H11-H4均具有较强的病毒中和能力。本研究将H11-D4、H11-H4的基因序列按照大肠杆菌密码子偏好性优化后进行合成，克隆到pET28a载体上后转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中诱导表达，经过简易的纯化和复性后对目的蛋白的中和活性做了初步检测，以期为中和性纳米抗体的大量原核表达提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂和仪器

大肠杆菌感受态细胞Trans5α、Rosetta（DE3）购自北京全式金生物技术有限公司；原核表达载体pET28a、人源胚胎肾细胞（HEK293T）、pcDNA3.1-ACE2-GFP质粒、pcDNA3.1-S质粒、pNL4-3.Luc.R-E质粒均购自义翘神州生物技术有限公司；实验所需基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司优化合成。限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、T4连接酶、萤火虫荧光素酶检测试剂盒、细胞裂解液均购自Promega公司；His标签蛋白纯化试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；VigoFect高效真核转染试剂购自苏州拜吉氏生物科技有限公司；鼠源His-tag单克隆抗体购自北京全式金生物技术有限公司；HPR标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥有限公司。

Orbitrap Fusion质谱仪购自Thermo Fisher Scientific公司；4600 mini荧光及化学发光成像仪购自上海鸥翔科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 H11-D4基因的获取及合成 从数据库中选取SARS-Cov-2中和性纳米抗体H11-D4的氨基酸序列（PDB：6YZ5_F），去掉H11-D4后7个氨基酸，根据大肠杆菌密码子偏好性、GC含量等进行优化。优化后的核苷酸序列两端加上限制性酶切位点BamHⅠ、EcoRⅠ，将终序列送至南京诺唯赞生物科技有限公司进行合成，获得pUC57-H11-D4质粒。

1.2.2 重组表达载体pET28a-H11-D4的构建 利用限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ对pUC57-H11-D4质粒以及pET28a载体进行双酶切，将目的片段H11-D4回收后用T4连接酶与pET28a载体连接，转化感受态细胞Trans5α后涂布于具有卡纳霉素的抗性平板，挑取单菌落提取质粒，经酶切验证和测序鉴定后获得重组质粒pET28a-H11-D4。

1.2.3 重组蛋白H11-D4的表达与纯化 将重组大肠杆菌质粒pET28a-H11-D4转化到大肠杆菌表达菌株Rosetta（DE3）中，涂布固体培养基后挑取单菌落至2YT液体培养基，37℃，12 h后以1∶100的比例转接到200 mL的2YT培养基中，37℃，200 r·min-1继续培养至OD600在0.6～0.8时加入IPTG，继续培养5 h。摇菌后收集菌体破碎，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。将包涵体沉淀用变性裂解液重悬，4℃搅拌过夜，12 000 r·min-1，4℃离心30 min，取上清。将His标签蛋白纯化介质灌柱后加入上清液，最后用变性洗脱液洗脱，收集纯化后的蛋白进行SDS-PAGE鉴定，用BCA法进行蛋白定量。

1.2.4 质谱分析与Western Blot鉴定 蛋白纯化后通过SDS-PAGE电泳获得单一条带，切下条带后送往中国农业科学院生物技术研究所中心实验室进行液相二级质谱分析。

对1.4中纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳，随后用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，以稀释3 000倍的鼠源His-tag为一抗，稀释6 000倍的HPR标记羊抗鼠IgG为二抗，孵育结束后，添加显色液用荧光化学发光仪成像。

1.2.5 重组蛋白H11-D4的复性与浓缩 将纯化后的包涵体蛋白用变性洗脱液（不含咪唑）稀释至150 μg·mL-1后装入透析袋中。将透析袋用密封夹夹好后按6、4、2、1、0 mol·L-1梯度依次降低透析液中的尿素浓度，透析液中添加适量的氧化还原剂，4℃低速搅拌透析，4～6 h更换新鲜透析液一次，最后用过滤后的PBS（pH 7.4），4℃透析过夜，高速离心去除沉淀。在上清中加入1%Triton X-114，冰浴30 min后37°C孵育10 min，12 000 r·min-1离心15 min，小心吸取上层水相至新的EP管中，重复此步骤2～3次即可去除内毒素。最后用超滤管（默克）进行超滤浓缩（pH 7.4），稀释至1 mg·mL-1，-80℃分装保存。

1.2.6 SARS-CoV-2假病毒构建及感染力测定将293T细胞以2×105·孔-1接种于6孔细胞培养板，37℃、5% CO2培养至细胞密度为80%。转染前1 h更换新鲜无血清DMEM培养基。按照Vigo-Fect说明书，将pNL4-3.Luc.R-E质粒与pcDNA3.1-S质粒共转染到293T细胞中。转染12 h后更换为含有10 % FBS的DMEM培养基。48 h后收获细胞上清，4℃，5 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液用0.45 μm滤膜过滤后分装，避免反复冻融，-80℃保存待用。

将293T细胞以2×104·孔-1接种于96孔板中，37℃、5% CO2培养至细胞密度为80 %。将pcDNA3.1-ACE2-GFP质粒转染到293T细胞中，3～6 h后更换含有10%血清的新鲜DMEM培养基，24 h后观察荧光，将假病毒2倍稀释10个梯度后加入96孔板中，每个稀释度设置3个重复。培养12 h后，去除假病毒上清液，更换含有10% FBS的DMEM培养基。48 h后检测荧光素酶活性，确定假病毒感染力。

1.2.7 中和试验 将293T细胞以2×104·孔-1接种于96孔板中，37℃、5% CO2培养至细胞密度为80 %时将pcDNA3.1-ACE2-GFP质粒转染到293T细胞中，24 h后观察荧光。分别将H11-D4和BSA从100 μg·mL-1进行5倍梯度稀释，共稀释10个梯度，与等体积假病毒（RLU=40 000）混合，DMEM与假病毒混合作阳性对照、仅加DMEM孔作阴性对照，每个样本设置3个重复孔。37℃孵育1 h后加入细胞中，培养12 h更换含有10% FBS的DMEM培养基，48 h后检测萤火虫荧光素酶表达量，计算纳米抗体对假病毒进入细胞的抑制率，并用GraphPad Prism计算其IC50。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pET28a-H11-D4鉴定

利用BamHⅠ、EcoRⅠ对重组质粒pET28a-H11-D4进行双酶切，鉴定结果显示（图1）分别在400、5 300 bp左右有明显条带，符合H11-D4片段和pET28a载体片段的理论长度387、5 369 bp，测序结果也表明序列正确，这说明H11-D4基因已经成功克隆到pET28a载体上。

图1 重组质粒pET28a-H11-D4双酶切鉴定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pET28a-H11-D4 by double enzyme digestion

2.2 重组蛋白H11-D4的表达

诱导表达前，使用ExPASy软件预测重组蛋白的分子量约为17.9 kD。通过筛选不同表达菌株、诱导温度、诱导剂种类和浓度及诱导时间等条件，发现大肠杆菌Rosetta（DE3）37℃培养至OD值为0.6时，加入1.0 mmol·L-1IPTG继续培养5 h后蛋白表达量最高，重组蛋白主要以包涵体沉淀形式表达，大小与预测值相符（图2），且在上清中未见明显条带。

图2 重组蛋白H11-D4的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein H11-D4

2.3 重组蛋白H11-D4的纯化与复性

利用镍柱亲和层析纯化得到目的蛋白，在不同浓度咪唑的洗脱液洗脱后发现洗脱液的最佳咪唑浓度为250 mmol·L-1。将纯化后的目的蛋白与未纯化表达产物进行SDS-PAGE验证，结果如图3A所示：纯化后目的蛋白条带单一，纯化效果良好。利用BCA法测定其浓度如图3B所示，结果显示每升菌液中纯化后的目的蛋白产量达到25.16 mg·L-1。按照前述过程透析复性后，用Triton X-114去除内毒素，浓缩、定量、分装后，-80℃保存备用。

图3 H11-D4纯化后的SDS-PAGE验证与浓度测定Fig.3 SDS-PAGE analysis and concentration determination after H11-D4 purification

2.4 质谱鉴定与Western Blot验证

为了确定上述实验获得的重组蛋白为H11-D4，进一步进行了Western Blot验证和质谱分析。Western Blot验证结果（图4）显示泳道2在预计的分子量附近可见特异性条带，表明大肠杆菌中成功表达了H11-D4蛋白。质谱结果显示大肠杆菌表达的H11-D4蛋白分子量为17.9 kD与预测值一致，蛋白覆盖率高达89.06%。

图4 H11-D4 Western Blot验证图Fig.4 Western Blot analysis of H11-D4

2.5 SARS-CoV-2假病毒感染力测定

为了验证假病毒能否感染表达ACE2的293T细胞，首先将pcDNA3.1-ACE2-GFP质粒转染到293T细胞中，24 h后观察荧光，如图5所示，大部分细胞出现绿色荧光，证明ACE2已经在细胞中表达。用假病毒感染表达ACE2的293T细胞后测得的感染力结果如图6所示：假病毒具有感染293T细胞的能力，并且感染力与稀释度显著相关（P＜0.01，Pearson相关分析），同时随着假病毒稀释度增加，感染293T细胞的RLU值逐渐下降。

图5 绿色荧光蛋白ACE2融合蛋白在293T细胞中的表达Fig.5 Expression of ACE2-GFP in 293T cells

图6 假病毒感染力测定Fig.6 Determination of pseudovirus infectivity

2.6 中和试验

本研究在SARS-CoV-2假病毒系统中插入了荧光素酶报告基因，该假病毒侵染了转染ACE2的293T细胞后，细胞中假病毒表达的荧光素酶与荧光素反应产生荧光。若纳米抗体与假病毒S蛋白中的受体结合域RBD结合，就能竞争性的抑制RBD与ACE2结合，从而阻止假病毒进入细胞，那么假病毒产生的细胞荧光值就会降低。根据检测到的光量子数计算纳米抗体H11-D4和BSA阻止病毒进入细胞的抑制率，使用GraphPad Prism 8绘制纳米抗体H11-D4对假病毒的中和活性曲线（图7），结果表明H11-D4能有效抑制假病毒进入细胞，且抑制率随H11-D4浓度的增大而增大，而BSA阴性对照抑制率接近于零，无抑制假病毒进入细胞的能力。利用GraphPad Prism 8计算出H11-D4的半数抑制浓度IC50为171.1 nmol·L-1。

图7 H11-D4对假病毒的中和活性曲线Fig.7 Neutralization activity curve of H11-D4 to pseudovirus

3 讨论

传统单克隆抗体普遍存在制备周期长、制备成本高等缺点，同时抗体相对较大还会导致组织渗透性较低，影响其治疗效果［13］。中和性纳米抗体大小只有传统单克隆抗体的十分之一，在很多疾病的预防和治疗中发挥了巨大作用［14-15］。此外，纳米抗体体积小且具有良好稳定性，可通过吸入给药，比较适合呼吸道疾病的治疗，在临床上具有巨大的应用潜力［16］。目前为止，纳米抗体已经可以在原核、酵母、昆虫细胞、真菌、哺乳动物细胞甚至植物细胞中表达，而大肠杆菌作为原核生物的金标准，是实验室环境下重组蛋白最重要的表达平台之一，其结构简单且操作简便，生产成本较为低廉，一般可以获得每升数十mg的产量［17-20］。

本研究将SARS-CoV-2中和性纳米抗体H11-D4基因序列根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化，在大肠杆菌中进行高效重组表达，37℃，OD600为0.6时添加1.0 mmol·L-1IPTG继续诱导5 h为最优诱导条件。大肠杆菌表达载体携带的His标签方便了重组蛋白的镍柱纯化，纯化后采用简易的透析复性并在复性液中添加一定量氧化还原剂，可大大提高目的蛋白的复性率，这种方法在纳米抗体H11-D4的纯化复性上效果较为理想［21］。复性后用TritonX-114重复抽提能够除去98%以上的细菌内毒素，蛋白回收率高达85%以上［22］。纳米抗体H11-D4的纯化和复性结果表明用上述方法能达到相当的纯化效果，在摇瓶条件下，纯化后的纳米抗体H11-D4表达量高达25.16 mg·L-1，通过假病毒中和试验可验证其具有较好的中和活性，IC50为171.1 nmol·L-1。Huo等［12］为了获得二聚体表达的纳米抗体将H11-D4与人IgG1-Fc结构域融合，用H11-D4-Fc纳米抗体进行中和试验所得IC50为161 nmol·L-1，然而Fc段分子量较大，二聚体形式的表达在临床应用上有可能失去纳米抗体分子量较小的优点，而本研究所用目的蛋白为单体表达，其分子量不到18 kD，但中和活性与二聚体表达形式的相应纳米抗体中和活性基本相当，足以说明本研究用较为简单的方式表达、纯化和复性了中和活性较高的新冠病毒中和抗体。综合来讲，本研究获得了新冠病毒中和纳米抗体H11-D4在大肠杆菌中的高效表达，建立了简易的纯化、复性过程，并通过中和试验验证了其中和活性，为纳米抗体表达的深入研究、小分子药物的生产奠定了一定的基础，在新冠病毒的预防和治疗中具有一定的应用前景。