TET酶的生物学功能及相关机制的研究进展

曾雨冰，何学佳，2，刘帆，3，裴培，王珊*

1.首都儿科研究所，儿童发育营养组学北京市重点实验室，北京100020；

2.北京大学首都儿科研究所教学医院，北京100020；

3.北京协和医学院研究生院，首都儿科研究所，北京100020

DNA甲基化可以调控基因的表达及沉默，参与胚胎发育及多种疾病的发生发展，是表观遗传修饰相关研究中最为广泛的一类。胞嘧啶（cytosine，C）以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）为供体，可在DNMT的催化下将甲基转移到胞嘧啶的C-5位上，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）［1］，从而完成DNA的甲基化过程。但DNA甲基化状态并非持续不变，5mC可通过氧化脱氨反应，产生G/T错配，被胸腺嘧啶DNA糖苷酶（thymine DNA glycosylase，TDG）选择性识别，随后通过碱基切除修复（base excision repair，BER），恢复胞嘧啶形式，实现DNA去甲基化［2］。

DNA甲基化在胚胎发育过程中需要经历2次重编程。第一次发生在配子首次重编程后。受精后，DNA甲基化会被全部擦除，到植入前的囊胚期，胚胎的DNA甲基化水平降至最低水平，此后，又重新建立表观遗传标记和印记；第二次发生在受精卵植入前期，父母来源的基因组均会经历相应的重编程过程，清除原有的表观遗传学修饰，再重新发生新的甲基化，形成正常发育的全能型胚胎［3-5］。10-11易 位 蛋 白（ten-eleven-translocation protein，TET）酶家族在DNA去甲基化过程中起到了关键的调控功能，它普遍存在于多数动物及低等真核生物中，且在原生生物及真菌中也有发现［6］。研究发现，在小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cell，mESCs）分化过程中，TET酶积极参与、介导DNA去甲基化过程，如TET1与转录抑制因子SIN3A结合，激活Lefty1，进而抑制Nodal信号通路［7］；TET3通过激活Sfrp4、抑制Wnt通路调节神经外胚层和心脏中胚层分化倾向［8］。此外，TET酶介导的DNA去甲基化还参与多条代谢相关通路［9-12］，以及维持机体内的动态平衡。

1 TET酶的分类与结构

TET酶属于2-氧戊二酸酯依赖性双氧合酶（2-oxoglutarate-dependent dioxygenases，2-OGDDs）家族。2003年，Lorsbach等［13］首次在混合系白血病（mixed lineage leukemia，MLL）患者体内发现了TET1。目前TET酶家族共发现3个同源蛋白，分别命名为TET1、TET2、TET3。

人源TET酶是分子量在180～230 kD之间的大分子蛋白，此外还存在较短的TET酶变体［9，14］。TET家族成员均具有保守的C端结构域，包含一个富半胱氨酸的结构域（cysteine-rich domain，CD）和一个双链β螺旋（double-stranded beta-helix，DSBH）结构域。DSBH结构域通过对Fe2+和α-酮戊二酸（alpha-ketoglutaric acid，α-KG）进行结合氧化5mC，CD稳定DSBH与5mC之间的整个催化反应结构［15］。TET1和TET3的N端包含DNA结合的CXXC结构域，该结构域可结合非甲基化的CpG二核苷酸；TET2由于染色体倒位缺乏CXXC结构域，由邻近基因IDAX编码；由于不同的启动子和/或可变剪接，从而产生了一些TET酶亚型，由于这些亚型缺乏与其相关的CXXC结构域，因此 具 有 组 织/细 胞 类 型 特 异 性（图1）［14，16］。2013年，徐彦辉等［15］解析了TET2-DNA复合物的晶体结构，为探究TET酶介导5mC氧化机制提供了结构基础。

图1 TET酶结构示意图[14]Fig.1 The structure of TET enzymes[14]

2 TET酶介导的DNA去甲基化机制

2009年，有研究发现，TET1可促使5mC氧化为5-羟 甲 基 胞 嘧 啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）［17］。DNA去甲基化分为DNA被动去甲基化及DNA主动去甲基化两种模式。①DNA被动去甲基化：指DNA复制过程中，由于DNMT1受抑制无法完成子链的甲基化，DNA甲基化状态无法维持，导致DNA甲基化被动稀释（passive dilution）［18］。②DNA主动去甲基化：是由TET酶将DNA序列中的5mC多次氧化，依次转变为5hmC、5-甲酰基胞嘧啶（5-formylcytosine，5fC）和5-羧基胞嘧啶（5-carboxylcytosine，5caC），最终5hmC被TDG选择性识别，通过BER，逆转为未修饰的胞嘧啶［19］。TDG-BER途径可能导致DNA链断裂，使基因组完整性受损，但在敲除TDG基因的小鼠受精卵中，其5mC去甲基化未受影响［20-21］。5hmC也可通过胞苷脱氨基酶（activation induced deaminase，AID）转化为5-羟甲基尿嘧啶，再依次经过TDG识别切除和BER途径完成去甲基化［19］。

3 TET酶的中间产物5hmC特点及分布情况

TET酶介导DNA主动去甲基化过程中，将5mC脱氢加氧，依次转变成5hmC、5fC和5caC，5hmC的羟甲基和5fC的甲酰基分别通过与头蛋白（noggin，NOG）的1-羧酸酯和胞嘧啶的N4环外氮形成氢键，因此，5hmC的羟基和5fC的羰基朝向相反的方向。生化分析表明，TET2的底物偏好是由TET2介导的氧化中氢提取效率不同引起的，5hmC和5fC在催化腔内的约束构象可能会阻碍它们选择有利的取氢方向，降低催化效率。因此，TET酶在进化上被调节为对5hmC反应较弱，并促进5hmC的生成，作为一个潜在的调节功能的稳定标记［22］。

5hmC的分布具有组织或细胞特异性。研究表明，5hmC在脑、肝、肾和结直肠组织中含量较高，在肺组织中含量相对较低，在心脏、乳房和胎盘中含量极低［23］，在神经元细胞中浓度最高［24］。不同神经元细胞类型中5hmC含量也存在差异，有研究证实，大脑中5hmC较5mC的总水平相对较高，其中额叶皮层组织中5hmC含量最为显著［25］。当组织或细胞处于疾病状态时，如与正常结直肠组织相比，5hmC在结直肠肿瘤组织中含量显著下降［23］；在肝细胞癌早期，5hmC含量已表现出明显下降的趋势［26］。

4 TET酶在疾病中的作用

TET酶参与调节DNA去甲基化过程，产生相应的表观遗传效应，可以促进或抑制机体发育及生物进程。TET基因过表达的情况下，5mC和5hmC的水平均可能由于底物耗竭而降低［27］。以下对TET酶在血液系统、神经精神系统、实体肿瘤等疾病中的作用进行分析。

4.1 TET酶异常在血液系统疾病中的作用

TET酶最早在血液系统疾病中被报道，研究表明，在MLL中存在TET1突变［28］。2009年，Tahiliani等［17］确定TET1为MLL基因的融合伙伴，并通过氧化5mC转变为5hmC，但其在白血病中的确切作用尚不清楚。2013年，有研究发现，TET1是MLL融合蛋白的直接靶点，MLL融合蛋白结合到TET1的启动子区，并直接促进其在人和小鼠造血干细胞或祖细胞中的表达，在MLL重排白血病中显著上调，导致5hmC水平整体增加（图2）［29］。

图2 MLL重排白血病中MLL融合蛋白结合TET1的作用模式图[29]Fig.2 Diagram of MLL fusion protein binding to TET1 on MLL-rearranged leukemia[29]

TET2在造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）及其祖细胞中高表达，随着分化的进行TET2水平下降。TET2参与造血干细胞的自我更新、谱系的承诺和造血细胞向特定谱系的最终分化［30］。TET2能调节甲基化驱动的基因沉默，进而控制基因表达。TET2缺失可造成造血干细胞或祖细胞突变，导致多种血液系统疾病的发生［31-32］。有研究报道，在急性髓系白血病（acute myeloidleukemia，AML）中存在WT1、TET2、IDH1和IDH2的互斥性突变［33］。此外，与TET2表达正常的髓系恶性肿瘤相比，除Apc、Nf1、Flt3、Cbl、Notch1、Mll2基因发生突变外，TET2突变导致的髓系恶性肿瘤会产生更多的突变事件。研究表明，在TET2突变的情况下，Notch1基因上有4个杂合突变，通过单细胞靶向外显子组测序发现，在Notch1上选定的13个位点中有7个明显突变频率更高［34］。另有研究报道，TET3维持5hmC表观遗传标记、早期骨髓祖细胞程序、关键葡萄糖代谢和STAT5A信号通路基因的表达，TET3在AML中被发现过度表达，因此，TET3消耗会阻碍AML细胞中的己糖激酶（hexokinase，HK）活性表达和L-乳酸（L-lactate）产生［35］。

4.2 TET酶异常在神经系统疾病中的作用

大量研究表明，5hmC在中枢神经系统中含量丰富，其表达水平与动物年龄呈正相关［23，36］。TET酶通过调控神经发育相关基因5hmC的水平，可以影响神经系统的正常发育和功能［37-38］。

Rudenko等［39］研究发现，敲除小鼠的TET1可使皮质和海马中调控神经元活动的基因Arc、Npas4、c-Fos、Egr2等失调，引起突触可塑性改变、记忆消退中特定的认知损伤，导致空间学习和记忆障碍；将TET1/2双敲除后，会导致围产期小鼠致死率上升，并伴有外脑畸形、脑出血、生长迟缓［40］；TET1/2/3三重敲除后，会导致小鼠神经中胚层及外胚层分化失调［8］。此外，在人胚胎干细胞中进行TET1/2/3三重敲除后，可影响神经发育相关的转录因子Pax6去甲基化［41］。

TET酶介导的DNA去甲基化与相对应的DNA甲基化过程的动态调节对胚胎神经系统发育起到了重要作用。Pax3作为参与神经管形成最重要的基因之一，其表达抑制可导致小鼠神经管畸形（neural tube defect，NTD）发生［42］；发育基因GLI2启动子区DNA甲基化程度增高可增加NTD的发生风险［43］。

TET酶损伤的相关疾病大多与神经精神系统相关。前期研究通过对抑郁样行为小鼠模型进行慢性社会失败应激处理，并检测小鼠脑中伏隔核TET1表达量的改变，发现仅应激敏感小鼠会出现TET1表达量的降低［44］；研究发现，早发性阿尔兹海默症和额颞叶痴呆患者中存在TET2功能突变［45］。最近有研究发现，TET3突变是智力障碍和颅面异常遗传综合征的致病基础［46］。

4.3 TET酶异常在实体肿瘤中的作用

DNA甲基化及去甲基化失衡会导致多种实体肿瘤的发生发展。TET酶突变导致基因功能丧失和5hmC含量降低是肿瘤发生的重要原因。研究发现，异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）家族中的IDH1和IDH2突变常发生在胶质瘤（gliomas）和AML中，其突变可产生2-羟基戊二酸（2-hydroxyglutarate，2-HG），而2-HG占据了α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）的活性位点，导致α-KG的活性丧失，进而抑制α-KG的依赖性双加氧酶，包括TET酶家族，导致全基因组组蛋白和DNA甲基化的改变［47］（图3）。TET3表达异常会导致神经胶质瘤5hmC水平整体降低，TET3 mRNA水平升高有助于产生更好的预后［48］。此外，在乳腺癌、黑色素瘤和胃癌等多种肿瘤中，均存在TET酶表达异常的现象［49］。

图3 突变IDH1/2调控TET酶模式图[47]Fig.3 Diagram of regulation of mutant IDH1/2 on TET[47]

在儿童肿瘤中，胶质母细胞瘤（glioblastoma）、肝母细胞瘤（hepatoblastoma，HB）等实体肿瘤同样与TET酶关系紧密，引起DNA甲基化和DNA去甲基化失衡，均会促进此类肿瘤的发生发展。研究表明，在胶质母细胞瘤中TET2与5hmC表达均下调，但在肝母细胞瘤中，TET和5hmC均升高，说明TET和5hmC在HB和成人肿瘤中的致瘤机制不同［50-51］。有学者推测，在胚胎发育过程中，TET酶高度表达并抑制分化，进一步推测HB的发生可能是由于分化早期肝脏分化受阻所致［52-53］。

近年来，借助于液体检验技术的快速发展，人们有能力在外周血检测到不同组织的细胞游离DNA（cell-free DNA，cfDNA），这对许多疾病的早期发现和及时干预起重要作用［54］。TET酶介导的DNA去甲基化中间产物5hmC，含量较高且具有较高的稳定性［55］，可被考虑作为肿瘤诊断及预后评判的金标准之一［26，56］。虽然有研究表明，小鼠胚胎干细胞中TDG的缺失可导致5caC蓄积至易于检测的水平［57］，但相较于5hmC的天然稳定性，其存在明显不足；并且结合上述关于TET在不同疾病中的变化，可以合理推测，5hmC检测技术也可在肿瘤转移及复发中发挥重要作用。但目前通过cfDNA检测5hmC来诊断疾病尚存在许多不足，其实用性证据也仍需进一步验证［58-59］。

5 展望

本文综述了DNA甲基化及去甲基化过程和TET酶在这一过程中发挥的调控功能，并归纳了目前TET在多种疾病中的调控作用，以及其在表观遗传学中的主要研究进展。虽然近年来，人们对DNA去甲基化的机制和功能进行了大量的研究，但仍有一些问题亟待解决：①尽管TET酶已被证实是通过调控DNA甲基化和去甲基化平衡参与调控生长发育和多种疾病，但在生长发育、疾病发展的不同阶段是否起到相同作用及机制尚未阐明；②TET酶及DNA去甲基化过程的中间产物作为潜在的生物标志物，灵敏度、特异性和实用性证据有待证实；③DNA甲基化及去甲基化过程具有非常复杂的机制，由许多不同的物质与TET酶共同调节，但该调控机制及TET酶在其中发挥的作用尚未完全阐明。未来可通过相应的研究阐明上述问题，进一步揭示DNA去甲基化过程，以及TET酶的相关作用机制，进而为疾病诊疗及降低出生缺陷发病率提供新思路。