高效液相色谱法测定复方香芍口服液中芍药苷含量*

丁家昱，韩宪忠△，番 正，夏荣松，袁文霄

（1.重庆市人民医院·中国科学院大学重庆医院，重庆 400014；2.重庆医科大学中医药学院，重庆 400016）

腹痛、腹胀、消化不良为临床多发病，西药解痉镇痛药物虽有一定止痛效果，但消除伴随症状作用较差，常有口干、心悸、呕吐恶心等药品不良反应发生。目前，市场上治疗腹痛的中成药较常见。重庆市人民医院以木香、白芍、厚朴、吴茱萸、甘草5味药材经提取、纯化工艺，最终制得复方香芍口服液。初步药效学与毒理学试验结果表明，该制剂具有缓解腹痛、胀满、消化不良、呕恶厌食的功效，且起效快、疗效好、副作用小，市场前景良好。方中白芍具有解痉、肌松、抗菌、保护消化道、治疗溃疡等作用［1］，其主要有效成分为芍药苷。本研究中建立了测定复方香芍口服液中白芍活性成分芍药苷含量的高效液相色谱法，以更好地控制产品质量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

CPA225D型电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司，精度为十万分之一）；Waters 2487型高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；Simplicity-185型超纯水机（美国Millipore公司）；SC-04型低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。

1.2 试药

芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号为111730-201307，含量为97.4%）；复方香芍口服液（医院制剂，编号分别为S1，S2，S3，规格为每瓶10 mL）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Waters SunFire C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈-0.05%磷酸二氢钾溶液（15∶85，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：230 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。精密量取供试品溶液10 μL，按此色谱条件进样测定，色谱图见图1 A。结果显示，芍药苷峰与其他杂质峰均能达到基线分离，分离度大于1.5，理论板数以芍药苷峰计大于3000。

2.2 溶液制备

精密量取样品1 mL，90℃水浴蒸至约0.5 mL，用10 mL甲醇溶液洗涤残余物，洗涤液转入10 mL离心管，离心（转速为3000 r/min）20 min，取上清液，置50 mL容量瓶中，10 mL甲醇洗涤沉淀，同法离心，合并上清液，加甲醇稀释并定容，摇匀。精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀；用0.22 μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。取芍药苷对照品12.00 mg，精密称定，置20 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容，摇匀，作为对照品贮备液；精密量取上述对照品贮备液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容，摇匀，即得对照品溶液。按相同处方比例和制备工艺，制备仅缺乏白芍的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：精密量取2.2项下对照品溶液和阴性对照品溶液各10 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，色谱图见图1 B和图1 C。可见，芍药苷保留时间为10.58 min，阴性对照品溶液色谱图中相应位置无此峰，表明杂质及阴性对照对测定均无干扰，该方法专属性良好。

图1 高效液相色谱图1.PaeoniflorinA.Test solution B.Reference solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密吸取2.2项下对照品溶液1，5，10，15，20 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量（X，μg）为横坐标、峰面积积分值（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=12543X+89144，r=0.9997（n=5）。结果表明，芍药苷进样量在0.059～1.180 μg范围内与峰面积积分值线性关系良好。

精密度试验：精密吸取2.2项下对照品溶液10 μL，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果芍药苷峰面积的RSD为1.20%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密量取样品（编号为S1）适量，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别于0，2，4，8，12 h时进样测定，记录峰面积，结果芍药苷峰面积的RSD为0.83%（n=5），表明供试品溶液在室温下12 h内稳定性良好。精密量取2.2项下对照品溶液10 μL，按2.1项下色谱条件分别于0，1，2，3 d时进样测定，记录峰面积，结果芍药苷峰面积的RSD为1.01%（n=4），表明对照品溶液在室温下3 d内稳定。

重复性试验：取同一批（编号为S1）样品适量，混匀，依法制备供试品溶液6份，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果芍药苷的平均含量为363.80 mg/mL，RSD为0.74%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取芍药苷对照品0.75 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，作为对照品浓溶液（质量浓度为15.37 mg/mL）。精密量取已知含量的样品（编号为S1，质量浓度为363.80 mg/mL）1 mL，共9份，分别加入对照品浓溶液8，10，12 mL，平行3份，依法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，按外标法计算含量，并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 样品含量测定

取3批（编号分别为S1，S2，S3）样品各适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，按外标法计算含量。结果3批（编号分别为S1，S2，S3）样品中芍药苷含量分别为363.80，368.75，370.55mg/mL，RSD分别为0.73%，1.21%，0.96%。

3 讨论

参考文献［2］及2020年版《中国药典（一部）》白芍［3］项下项目，测定芍药苷含量时流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86，V/V），检测波长为230 nm。预试验中，复方香芍口服液中存在杂质峰，未能与芍药苷峰得到有效分离，严重干扰后者的测定。参考文献［4-16］，分别以乙腈-0.1%磷酸溶液［4，6-8，14］、乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（7∶13∶80，V/V/V）［9］、乙腈-0.05%磷酸二氢钾溶液［10，15］、乙腈-0.4%磷酸溶液（20∶80，V/V）［11］等为流动相系统，考察芍药苷与其他组分的分离效果。综合考虑，最终确定2.1项下色谱条件，在此条件下芍药苷与其他组分分离良好。

木香、白芍、厚朴、吴茱萸、甘草组方中含有大量的多糖类物质，溶液呈胶体状，不能直接进行高效液相色谱分析，其他组分干扰严重。在样品前处理过程中，分别考察采用50%甲醇和甲醇作为溶剂，沉淀杂质并稀释样品，取上清液，滤过，分别进样测定，色谱峰分离均较好，但甲醇作为溶剂的杂质峰更少。故采用甲醇沉淀及分离多糖类物质。

曾考察3个厂家的同类型色谱柱，结果样品中芍药苷色谱峰峰形良好，与杂质均达到基线分离，含量测定结果基本一致，表明方法对色谱柱的耐用性良好。

综上所述，本研究中建立的方法简便快速、专属性强、重复性好，适用于复方香芍口服液中白芍的主要活性成分芍药苷的含量测定。