高效液相色谱法同时测定醒脾养儿颗粒中6种咖啡酰奎宁酸类成分含量*

2022-10-11朱帮会刘春花李勇军

中国药业 2022年19期

朱帮会，李银，马雪，汪洋，刘春花，田琳，李勇军△

（1.贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心·省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州贵阳 550004；2.贵州医科大学药学院，贵州贵阳 550004；3.贵州医科大学·贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳 550004；4.贵州健兴药业有限公司，贵州贵阳 550018）

醒脾养儿颗粒由一点红、毛大丁草、蜘蛛香、山栀茶4味中药材制备而成，具有醒脾开胃、固肠止泻、养血安神等功效，临床广泛用于治疗儿童厌食、腹泻、肠炎、遗尿等［1-5］。现行质量标准中仅有一点红和毛大丁草的薄层色谱鉴别、醇溶性浸出物含量规定及颗粒剂常规检查等项，质量标准较单一，存在质量控制体系不完善、药效物质基础不明确等问题。咖啡酰奎宁酸类成分为醒脾养儿颗粒中4味药材的共有成分，具有抗炎、抗菌、免疫调节等作用［6-7］。目前，关于药材中咖啡酰奎宁酸类含量测定的研究报道较多，但尚未见醒脾养儿颗粒中此类成分的相关报道。为进一步完善醒脾养儿颗粒质量标准，本研究中建立了同时测定6种咖啡酰奎宁酸类成分含量的高效液相色谱法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo Fisher UltiMate 3000型高效液相色谱仪（配有系统控制器、输液泵、脱气组件、低压梯度组件、自动进样器、柱温箱、温控样品室、UV-DAD检测器及Chromeleon色谱数据工作站），Multifuge X3R型高速冷冻离心机，均购于美国Thermo Fisher Scientific公司；Mettler EL-204型电子天平（精度为万分之一），Mettler AE-240型电子天平（精度为十万分之一），均购于梅特勒-托利多仪器<上海>仪器有限公司；KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为200 W，频率为40 kHz）；WP-UP-IV-10型超纯水机（四川沃特尔科技发展有限公司）。

1.2 试药

新绿原酸对照品（批号为wkq21010802），绿原酸对照品（批号为wkq20042702），隐绿原酸对照品（批号为wkq20082705），异绿原酸B对照品（批号为wkq21022206），异绿原酸A对照品（批号为wkq21020306），异绿原酸C对照品（批号为wkq21012501），纯度均不低于98%，均购于四川省维克奇生物科技有限公司；乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯，水为超纯水；醒脾养儿颗粒（共21批，贵州健兴药业有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ACE Excel 5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：325 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 Program of gradient elution of mobile phase

2.2 溶液制备

分别精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C对照品适量，加25%甲醇溶解，制成质量浓度分别为0.960，0.978，1.013，0.960，0.966，0.999 mg/mL的对照品贮备液。分别精密量取上述对照品贮备液适量，置10 mL容量瓶中，加25%甲醇稀释并定容，摇匀，即得质量浓度分别为0.05306，0.08400，0.06857，0.02796，0.01447，0.04115 mg/mL的混合对照品溶液。取样品2.0 g，精密称定，置50 mL磨口具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇10 mL，称定质量，超声处理（功率为200 W，频率为40 kHz）45 min，放冷，再次称定质量，加25%甲醇补足减失的质量，离心（转速为14000 r/min）10 min，取上清液，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别吸取空白溶液及2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果表明，供试品溶液与混合对照品溶液色谱中各相应色谱峰保留时间一致，各待测成分与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，且空白溶液无干扰，表明方法专属性良好。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图1.Neochlorogenic acid 2.Chlorogenic acid 3.Cryptochlorogenic acid 4.Isochlorogenic acid B 5.Isochlorogenic acid A 6.Isochlorogenic acid C A.Blank solution B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密吸取2.2项下混合对照品溶液适量，加25%甲醇逐级稀释，得系列梯度浓度混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，以对照品溶液质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表2。

表2 6种咖啡酰奎宁酸类成分线性关系考察结果（n=6）Tab.2 Results of the linear relation test of six caffeoylquinic acids（n=6）

精密度试验：取样品（批号为20210117）适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件平行进样6次，记录峰面积。新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C色谱峰峰面积的RSD分别为0.12%，0.11%，0.14%，0.31%，0.25%，0.23%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为20210117）6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。结果新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C平均含量的RSD分别为0.37%，0.32%，0.25%，1.55%，1.57%，0.94%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取重复性试验项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，4，8，12，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录6种待测成分峰面积。结果新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C色谱峰峰面积的RSD分别为0.55%，0.73%，0.88%，1.18%，0.65%，1.30%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为20210117）6份，每份1.0 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，分别加入新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C对照品0.1210，0.1740，0.1470，0.05296，0.02648，0.06691 mg，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以外标法计算加样回收率。结果见表3。

表3 加样回收试验结果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.4 样品含量测定

取21批样品各2.0 g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以外标法计算各成分含量，结果见表4。可见，21批样品中6种咖啡酰奎宁酸总含量为0.30291～0.68319 mg/g，平均含量为0.48599 mg/g。

表4 样品含量测定结果（mg/g，n=2）Tab.4 Results of the content determination of six caffeoylquinic acids in the samples（mg/g，n=2）

3 讨论

3.1 提取方法选择

曾考察超声和回流2种提取方式，提取效果差异不明显，故选择更简便的超声提取法。曾考察不同体积分数（25%，50%，75%，100%）的甲醇和乙醇作为提取溶剂时待测成分的峰面积。综合考虑节省溶剂、环保等因素，以25%甲醇提取时各待测成分的峰面积较大。曾考察不同提取时间（15，30，45，60 min）对提取效果的影响，发现超声提取45 min时各待测成分的提取率最大，故选择提取时间为45 min。

3.2 色谱条件优化

曾考察甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相，结果流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液时6种待测成分能在25 min内同时检测，且待测成分峰形较好，分离度均大于1.5。曾考察不同品牌色谱柱的分离效果，结果ACE Excel 5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）具有较高的柱效，待测成分与杂质峰区分效果明显。根据DAD全波长扫描结果，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C均于325 nm波长处有最大吸收。故选择325 nm作为检测波长。同时，考察不同柱温（25，30，35℃）和不同流速（0.8，1.0，1.2 mL/min）对待测成分分离度和峰形的影响。结果表明，在固定色谱柱，柱温分别为25℃和35℃、流速为0.8 mL/min时各峰分离度小于1.5时峰形较差，当柱温为30℃、流速为1.0 mL/min时各峰分离度均大于1.5，且方法学考察结果符合相关要求。故选择柱温为30℃，流速为1.0 mL/min。

3.3 指标成分选择

目前，醒脾养儿颗粒在临床研究多集中于临床疗效与单味药材的化学成分分离鉴定，对物质基础与质量评价却鲜有报道。《国家药品监督管理局国家药品标准》WS-10337-（ZD-0337）-2002-2012Z作为目前醒脾养儿颗粒的执行标准，仅有薄层色谱鉴别项，未对含量测定进行相关规定。陶剑美等［8］采用紫外分光光度法对醒脾养儿颗粒中的总黄酮进行测定；舒波等［9］采用高效液相色谱法测定熊果苷、槲皮苷、缬草三酯和乙酰缬草三酯的含量。醒脾养儿颗粒处方药材中含有黄酮类、香豆素类、咖啡酰奎宁酸类、萜类、木脂素类等多种化学成分［10-13］，成分复杂，其功效往往是多种有效成分共同作用的结果，在优先选择君药、臣药及其他药味专属性成分进行含量测定时，方中药味所含共有成分可能会被忽略。在对质控指标进行探索性研究中，通常以其中一个指标成分作为定性鉴别和定量检测的对象，但中药及中药复方制剂成分种类复杂，只对其中任意1种成分进行检测不能体现整体性，共有成分通常是反映制剂整体质量控制的指标，故对共有成分进行含量测定具有重要意义。参考文献［6，14］，咖啡酰奎宁酸类成分作为醒脾养儿颗粒中4味药材的共有成分，其含量相对较高且较稳定，具有抗菌、细胞保护、免疫调节等良好的药理活性。故选择咖啡酰奎宁酸类成分作为醒脾养儿颗粒的含量测定指标。