假基因POU5F1B 在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

段达荣，蔡莎莎，林芯伊

（台州市第一人民医院检验科，浙江 台州 318020）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种常见的恶性肿瘤，是危害人类健康的主要恶性肿瘤之一[1]，在西方发达国家中高发。随着我国人们生活水平提高，结直肠癌发病率亦逐年上升，其病因和发病机制目前尚不完全清楚，普遍认为结直肠癌的发生、发展与遗传和环境等多种因素导致基因改变有关[2-4]。结直肠癌患者5 年生存率为50%～60%，早期准确诊断对提高患者的生存率至关重要。但是目前对结直肠癌尚缺乏较好的早期诊断和疗效判断指标。本研究利用转录组测序技术（RNA-Seq）分析假基因POU5F1B（POU domain class 5 transcription factor 1B，POU5F1B）与结直肠癌的发生的关系，旨在为临床诊断和治疗提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017 年1 月-2021 年10 月台州市第一人民医院收治的进行手术切除并经病理证实的143 例结直癌患者临床病理资料及术后标本。其中男90 例，女53 例；年龄55～81 岁。所有直肠癌标本经病理检查证实为原发性直肠癌，癌旁组织标本为距离肿瘤2 cm 外的结直肠组织，病理组织学检查均证实为无癌变。本研究经本院伦理委员会通过，患者或其家属签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①结直肠癌诊断符合《中国结直肠癌诊疗规范（2017 年版）》标准[5]。②所有的患者均为初诊，且按标准化结直癌手术治疗；③术后的病理诊断证实为结直肠癌，同时根据AJCC 第7 版TNM 分期标准进行分型；④采集样本前患者未接受任何靶向抗肿瘤、新辅助放化疗等治疗。排除标准：患者有血液病、其它部位的肿瘤或者其它部位转移引起的结直肠癌等疾病不在本研究范围。

1.3 仪器与方法

1.3.1 仪器 4 ℃、-20 ℃冰箱（青岛海尔公司）；-80 ℃冰箱（日本三洋公司）；全自动图像分析系统/凝胶成像仪RED（美国Proteinsimple 公司）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；光学显微镜（日本Olympus）。

1.3.1 RNA-Seq 检测 收集原发性结直肠癌组织标本、相应的癌旁组织标本送至北京诺禾致源科技股份有限公司应用转录组测序技术（RNA-Seq）进行检测，使用cBioPortal for Cancer Genoics 软件进行分析。

1.2.2 免疫组化染色 将结直肠癌组织及癌旁组织切片常规脱蜡入水后进行免疫组化染色，检测POU5F1B 细胞的表达情况。免疫组化实验步骤按二步法组化检测试剂盒说明书进行。一抗稀释比例均为1∶100 以PBS 代替一抗为阴性对照。免疫组化染色具体步骤：组织及时适当取材、充分固定，石蜡包埋、完整切片（厚度4～6 μm），载玻片需经清洗和防脱片处理。放入70 ℃电热恒温干燥箱烤片1 h。石蜡切片脱蜡、水化。脱蜡要彻底，室温较低时在37 ℃温箱中进行脱蜡或适当延长时间。用PBS（pH7.4）冲洗3 次，5 min/次。EDTA 抗原修复液直接煮沸抗原修复法对组织进行相应的修复。PBS 冲洗3 次，5 min/次。加入过氧化酶阻断溶液，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS 冲洗3 次，5 min/次。加1～2 滴POU5F1B 抗体，放入专用孵育盒内，在32 ℃水浴箱内孵育1 h。PBS 冲洗3 次，5 min/次。加聚合物增强剂（第二抗体），放入专用孵育盒内，在32 ℃水浴箱内孵育30 min。PBS 冲洗3 次，5 min/次。加2 滴新鲜配制的DAB 溶液，在显微镜掌握显色时间。自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固，显微镜下观察。

1.4 结果判定 在光镜下结合染色强度和阳性细胞百分比判断POU5F1B 蛋白阳性表达率。以肿瘤细胞胞浆上出现棕褐色颗粒为阳性表达，染色愈浓代表阳性表达愈强。选取背景清晰的视野，在100 倍显微镜下观察，按组织染色深浅分为：未染色记作0分；浅黄色记作1 分；棕黄色记作2 分；棕褐色记作3 分。选取染色均匀的区域于400 倍显微镜下观察，记录5 个视野中阳性细胞的百分比，计算其平均值。按染色细胞的比例分为4 分：0～25%记作0 分；25%～50%记作1 分；50%～75%记作2 分；＞75%记作3 分。组织染色强度与染色细胞百分比级别之乘积：＜3 分为阴性，3～6 分为阳性，＞6 分为强阳性。应用Imagepro-Plus6.0 图像分析软件对所有免疫组化指标的染色强度及面积进行计算分析。随机选取3 个视野通过图像分析软件提取免疫组化指标的积分光密度值（IOD），取其平均值代表POU5F1B 指标的阳性表达水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析。计数资料使用（n）表示。计量资料使用（）表示，两组比较采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 假基因POU5F1B 在结直肠癌组织、癌旁组织中表达的比较 用RNA-Seq 检测发现结直肠癌组织有1520 个差异基因（上调基因有989 个，下调基因有531 个），同时发现POU5F1B 基因位于染色体8q24 上，在直肠癌组织、癌旁组织这两组倍数变化（log2FoldChange）为4.544，两组中表达差异的显著性水平（-log10padj）为12.569，POU5F1B 基因为上调基因，并且显著高于其它基因，结直肠癌组织与癌旁组织有显著性差异（P＜0.05），见图1。

图1 RNA-Seq 检测结直肠癌组织与癌旁组织不同基因表达火焰图

2.2 结直肠癌及癌旁组织中假基因POU5F1B 表达情况 对143 例结直肠癌及癌旁组织进行组化染色，根据免疫组化指标的染色强度及面积进行计算，结果癌组织中假基因POU5F1B 表达为（1.51±0.68），癌旁组织为（0.34±0.54），差异有统计学意义（P＜0.05），如图2。

图2 结直肠癌组织及癌旁组织中假基因POU5F1B表达情况

2.3 结直肠癌及癌旁组织假基因POU5F1B 组化染色情况 对癌旁组织及癌组织进行组化染色，癌旁组织细胞胞浆不着色或浅黄色，为不表达或低表达，癌组织细胞胞浆呈棕黄色，占比约80%，为高表达，见图3。

图3 结直肠癌及癌旁组织POU5F1B 组化染色情况

3 讨论

根据国际癌研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）2018 年公布数据显示，结直肠癌作为一种常见的癌症在男女发病率分别排第3 名和第2 名[6]，死亡率占所有肿瘤死亡的8%。随着社会经济的发展，人们的生活水平不断提高，饮食的结构发生变化，结直肠癌发病率在逐渐上升[7-9]。目前，结直肠癌治疗方法主要有主要以手术和化疗为主，但不可避免出现术后及化疗后的复发，导致治疗失败，甚至患者死亡。研究显示[10-12]，淋巴结转移可以导致结直肠癌复发并对预后及生存产生影响。因此，如何预防治疗过程中的淋巴结转移，对延长患者的生存时间意义重大。本研究显示，假基因POU5F1B 在肿瘤细胞中的表达高低与淋巴结转移及生存时间有关，其对预后有重要的临床意义。

假基因POU5F1B 位于染色体8q24 上，具有促进细胞生长和编码功能蛋白的能力，与癌基因的激活、抑癌基因的失活、碱基错配修复及修饰基因的突变等在细胞癌变过程中发挥重要作用，最终引起组织病理学的变化及相关基因、蛋白质的改变[13-15]。假基因POU5F1B 是细胞多能性的主要调节剂，不仅在胚胎发生过程中而且在肿瘤发生过程中都发挥重要作用[16，17]。有研究表明假基因POU5F1B 的表达与预后呈负相关，只有在睾丸生殖细胞肿瘤中表现为正相关[18]，也有研究发现发现假基因POU5F1B 表达水平与胰腺癌和肝脏细胞癌的恶性程度均呈正相关[19]。Pan Y 等[20]也发现假基因POU5F1B 在肝癌细胞株中高表达，并且POU5F1B 表达水平与患者的不良预后呈正相关。本研究在结直肠癌患者中也发现假基因POU5F1B 在结直肠癌组织中表达升高，表达高低与肿瘤恶性程度呈正相关性，也与病情的转归呈相关性，说明POU5F1B 在结直肠癌表达机制与其它消化道肿瘤相似。在134 例患者中，无围术期死亡发生，术后随访期间8 例发生复发或转移，对这8 例患者结直肠癌组织进行免疫组化染色，并应用Imagepro-Plus6.0 图像分析软件对所有免疫组化指标的染色强度及面积进行计算分析发现，结直肠癌组织异常高于其它未发生复发或转移者，说明假基因POU5F1B 与病情的转归、预后、生存时间呈相关性，可以有效评估患者生存时间及手术治疗方案。然而，假基因POU5F1B 表达高低是否还与其它因素（如肿瘤细胞的AKT 磷酸化）有关，有待进一步研究。

综上所述，假基因POU5F1B 在结直肠癌患者肿瘤组织中为上调基因，表达水平与肿瘤的恶性程度呈正相关，临床可用假基因POU5F1B 表达水平评估患者结直肠癌肿瘤的恶性种度。