TIM-3 在常见肿瘤中的表达研究

薛 飞，赵颖海

（广东医科大学病理系，广东 湛江 524023）

21 世纪以来，肿瘤免疫兴起，免疫治疗逐渐得到重视，如阻断肿瘤负向免疫调控机制的抗CTLA-4和PD-1 或PDL-1 抗体、嵌合抗原受体T 细胞、肿瘤树突状细胞疫苗等逐步展开。针对传统的CTLA-4、PD-1/PDL-1 等免疫检查点的阻断策略已经取得较大的成功，现阶段迫切需要发掘和研究新的免疫抑制点。作为新型免疫检查点之一的TIM-3，其表达及功能为近年来研究热点之一，已被发现在多个系统的常见的恶性肿瘤中发挥作用。目前，检测TIM-3表达的方法较多，不同研究常常出现多种联合检测方法，并且TIM-3 表达方式多样。针对TIM-3 的具体表达模式及不同实验技术方法检测下其表达意义是否一致，本文通过分纳归类不同实验技术方法检测下常见肿瘤中TIM-3 表达的状态及意义，旨在全面的认识TIM-3。

1 TIM-3 及其配体

TIM 基因家族于2001 年被发现，在人类中，该基因成员位于5q33.2 染色体带上，包括HAVCR1、HAVCR2 和TIMD4，分别编码TIM-1、TIM-3 和TIM-4 分子，其中TIM-3 受到更多关注。TIM-3 是一种跨膜蛋白，分为胞外区、跨膜区及胞内区，其中胞外区由IgV 结构域（含有N-连接糖基化位点）和粘蛋白样结构域（含有O-连接糖基化位点）组成，而胞内区为其胞浆尾巴[1]。TIM-3 表达于多种免疫细胞，研究发现，TIM-3 主要表达于Th1 细胞，另外也可在Th17 细胞、调节性T 细胞（Regulatory T cells，Tregs）、CD8+T 细胞、树突状细胞（Dendritic cells，DCs）、单核细胞、巨噬细胞和NK 细胞上表达等[2]，在调节细胞免疫及先天免疫中起重要作用。目前，已知TIM-3 的配体[3，4]包括半乳糖凝集素-9（Galectin-9，Gal-9），磷脂酰丝氨酸（PtdSer），高迁移率族蛋白1（HMGB-1）及癌胚抗原细胞粘附分子1（CEACAM-1）。GAL-9 广泛于表达多种细胞，能特异性识别TIM-3 IgV 结构域，最常见的作用是与TIM-3 结合后通过改变细胞内的钙离子流量，诱导Th1 细胞凋亡，从而抑制肿瘤免疫。PtdSer 常暴露在凋亡细胞的细胞膜上，可识别树突状细胞（DC）上的TIM-3，介导抗原交叉提呈。HMGB-1 是由免疫细胞分泌的一种炎症介质，正常情况下，HMGB-1 先与细胞死亡后暴露的核酸结合，并在与晚期糖基化终产物和Toll 样受体结合后，介导内化将其运输至DC 内体小泡，从而触发免疫反应。在肿瘤微环境中，HMGB1 高表达于肿瘤浸润性DC，TIM-3 与HMGB1 结合，阻断其核酸向内体运输，从而抑制先天免疫反应。CEACAM-1 是最新发现的TIM-3 的配体，可通过顺式二聚体相互作用促进TIM-3 的成熟和稳定，抑制T 细胞活性，目前被认为在某些抗病毒反应中起调节作用。

2 不同实验技术检测TIM-3 的表达

2.1 流式细胞术 流式细胞仪为集光电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学、抗体技术为一体的高科技细胞分析仪，流式细胞术则是利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术，已知不少研究运用这一技术检测TIM-3 的表达。研究发现，TIM-3 常常在肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）表达上调。其中，Gao X 等[5]和吉芃等[6]发现，在非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancers，NSCLC）中CD4+TIL 上TIM-3 的表达水平与患者生存预后呈负相关；Zhou GY 等[7]在研究原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）时也观察到瘤内CD4+和CD8+T 细胞上TIM-3 的表达高于癌旁组织。另外，TIM-3 在肿瘤患者外周血中同样有表达上调。Takano S 等[8]检测胃癌患者肿瘤组织和外周血中CD8+T 细胞表面TIM-3 和PD-1 的表达时发现，相比于健康对照组，两者CD8+T 细胞表达PD-1 和TIM-3 均有上调，其中肿瘤组织内PD-1+CD8+T 细胞和TIM-3+CD8+T 细胞数量明显多于外周血。此外，该研究还发现共表达PD-1 和TIM-3 的CD8+T细胞分泌IFN-γ 的功能显著低于PD-1-TIM-3-和PD-1+TIM-3-CD8+T 细胞，提示TIM-3 和PD-1 的表达与CD8+T 细胞功能受损相关。Piao YR 等[9]研究发现，前列腺癌患者外周血CD4+和CD8+T 细胞上TIM-3 的表达均明显高于良性前列腺增生患者，Zhang W 等[10]研究显示，膀胱癌患者外周血NK 细胞TIM-3 显著上调，TIM-3+NK 细胞毒性显著降低，TIM-3+NK 细胞频率越高的患者相应肿瘤细胞Gal-9 阳性率越高，并与患者预后总体呈负相关。Li XE 等[11]研究发现，胶质瘤患者外周血CD3-CD56+NK 细胞数量明显减少，不仅如此，TIM-3 在CD3-CD56+NK 细胞和CD14+单核细胞的表达均高于健康对照组，其表达水平与患者肿瘤细胞Ki-67指数呈正相关。另外，该研究还表明，TIM-3+NK 细胞分泌IFN-γ 能力明显降低，TIM-3+单核细胞表现为M2 表型数量上升，TIM-3 在胶质瘤的免疫中起负性调节作用。总之，TIM-3 的高表达与患者的不良预后相关，TIM-3 的上调可能导致相关免疫细胞功能的受损，从而促进肿瘤的发生发展，这一点在关于食管癌[12]、结直肠癌[13]、滤泡性细胞淋巴瘤[14]等的研究中也得到了证实。

2.2 免疫组织化学法 免疫组织化学通过抗体与所识别的组织或细胞中的抗原成分的特异性结合来鉴定目标抗原分子，常常由两个要素组成，即识别组织或细胞中的抗原成分的抗体以及标记于抗体上的示踪剂。示踪剂包括酶分子，荧光素分子和重金属原子等，而根据示踪剂的不同可将免疫组织化学分为免疫荧光、免疫酶技术、免疫电镜等。Li Z 等[15]运用免疫组织化学法检测发现，HCC 组织中TIL 上TIM-3 的表达明显高于癌旁组织，同样表达上调的还有PD-1，两者表达呈正相关，其表达水平与肿瘤的分级显著相关。Wang YY 等[16]发现，TIM-3 与食管胃交界部腺癌患者Siewert 分型密切相关，TIM-3 主要表达于TIL，TIM-3 和Gal-9（肿瘤细胞上表达）双阳性者预后显然更差。同样，Liu ZJ 等[17]研究显示，瘤内Gal-9 的表达与TIL 上TIM-3 的表达水平与胶质瘤的WHO 分级有关。TIM-3 不仅可表达于免疫细胞，也可以表达于肿瘤细胞。有关子宫内膜癌[18]及宫颈癌[19]的研究表明，与癌旁或良性组织对比，TIM-3 既可在TIL 中高表达，也可在肿瘤细胞中过表达。前者展开关于TIM-3 与错配修复蛋白在子宫内膜癌的表达研究，其结果表明，在MLH1 高甲基化、MSH6 缺失和中-高级别组织学分级的情况下，肿瘤细胞TIM-3 的表达水平明显增高，提示抗TIM-3 治疗在子宫内膜癌或林奇综合征患者中起潜在作用；后者检测分析TIM-3 与Gal-9 及PDL-1的关系，发现86%的PD-L1 阳性病例，包括100%PD-L1 阳性宫颈鳞癌中存在TIM-3/Gal-9 双重表达，提示抗TIM-3 与抗PD-1/PD-L1 可能具有协同作用。在结直肠癌的相关研究中，有研究显示[20]，TIM-3 在肿瘤组织中的表达水平高于正常组织，其表达水平与肿瘤大小、TNM 分期和远处转移显著相关。但Sun QY 等[21]的研究相反，该研究结合了TIM-3mRNA 的检测及TIM-3 蛋白水平定量，显示TIM-3 在结肠癌组织中的表达低于正常组织和癌旁组织，其与临床病理参数的分析表明，TIM-3 表达下调与大肠癌的侵袭和转移有关。类似的争议还有，如Piao YR 等[9]发现TIM-3 在前列腺肿瘤组织（含上皮内瘤变及腺癌）中的表达明显高于瘤旁组织，与前列腺特异性抗原水平呈正相关，TIM-3 高表达提示前列腺癌患者的不良预后。然而，Wu JL 等[22]研究显示，TIM-3 表达阴性的转移性前列腺癌和转移性去势抵抗性前列腺癌患者的总生存期较短，可作为两者预后不良的独立预测因素。另外，还有研究表明[23]，TIM-3 在肾细胞癌原发灶或转移瘤中的表达与患者较长的无进展生存和总生存期有关。运用免疫组织化学法进行TIM-3 研究的常见原发肿瘤还包括胰腺癌[24]、食管癌[25，26]、口腔癌[27]、头颈部鳞状细胞癌[28]、乳腺癌[29]、肺癌[30]等，涵盖多个系统。总体而言，均较一致地显示TIM-3 在肿瘤组织中的表达高于瘤旁，且与患者TMN 分期呈正相关，这与运用流式细胞术检测TIM-3 的结果基本相符，但TIM-3 在部分肿瘤的表达及作用仍存在争议，还需要进一步的研究来验证。

2.3 聚合酶链反应/连接酶检测反应（PCR-LDR）基因多态性又称遗传多态性，是指一个生物群体中同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因。关于TIM-3 基因多态性与癌症风险关系的研究发现[31]，TIM-3 单核苷酸多态性与多种人类癌症的易感性相关。Cui SJ 等[32]采用PCR-LDR 法检测TIM-3 的基因多态性，结果显示TIM-3 rs10053538C＞A 等位基因可增加食管癌的发病风险，并通过调节TIM-3 的表达影响患者的预后。Liu YB 等[33]研究发现，TIM-3 rs10053538 和rs10515746 与大肠癌的易感性无关，然而，rs10053538 的CA+AA 基因型与晚期临床分期和淋巴结转移风险增加有关，携带rs10053538 的CA+AA 基因型患者的无病生存期和总生存期明显短于CC 基因型患者，这一点在Wu JL 等[34]关于卵巢癌与TIM-3 基因多态性的关系的研究得出的结论基本一致。除此以外，有关乳腺癌[35]的研究报道，TIM-3 rs10053538GT+TT 基因型不仅增加乳腺癌的遗传易感性，还与TIM-3 高表达和淋巴结转移情况相关。由此可见，越来越多的证据显示，TIM-3 基因的多态性与肿瘤的发生发展有着一定的联系。

2.4 多种聚合酶链反应（PCR）目前常用的方法包括逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）等，TIM-3 mRNA 的检测可以较为直观且准确地反映TIM-3 基因的表达，避免某种情况下基因表达不完全反映在蛋白水平中。检测标本来源可分为患者的血液、肿瘤病灶或培养的肿瘤细胞系等。Yu MM 等[20]提取肠癌组织和癌旁组织的总RNA 进行RT-qPCR 分析，结果显示肿瘤组织内TIM-3 mRNA 表达水平是癌旁组织的5 倍以上。有学者[36]系统地研究了与免疫逃逸和T 细胞耗竭有关的不同基因在结直肠癌患者的肿瘤组织、配对的正常组织及血循环中的表达水平，结果显示，尽管结直肠癌患者循环中TIM-3 mRNA 表达水平与健康人相似，但肠癌组织中包括TIM-3 在内的多个免疫抑制点的mRNA 水平显著升高，提示患者机体的免疫功能受抑状态。另外，研究对比结直肠癌早期和晚期之间基因表达差异显示，TIM-3 mRNA 在晚期肿瘤组织中表达升高，提示其在结直肠癌进展中可能起作用。除此以外，已知在食管癌[12]、卵巢癌[34]、乳腺癌[37]、宫颈癌[38]等多种肿瘤中，肿瘤细胞或TIL 中TIM-3 mRNA 的表达水平均明显升高，并与肿瘤组织学分级、淋巴结转移等呈正相关，与患者的预后呈负相关。

2.5 蛋白质免疫印迹（Western blot）通过Western blot 法将蛋白质转移到膜上，利用抗体进行检测，可定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况。检测标本常常是肿瘤病灶或培养的肿瘤细胞系。目前已应在胃癌[39]、结直肠癌[20]、乳腺癌[29，37]及宫颈癌[38]等中发现，TIM-3 表达上调往往提示患者的预后不良。

2.6 体外细胞实验 体外细胞实验包括细胞迁徙侵袭检测、Transwell 实验、细胞凋亡检测、细胞增殖检测等，主要应用于目标肿瘤细胞系的研究。Cheng SQ等[29]通过AdV-TIM-3 上调和TIM-3-siRNA 下调TIM-3 在乳腺癌细胞系中的表达水平，证实TIM-3过表达可促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡，而TIM-3 失表达则作用相反，这点与TIM-3 在宫颈癌细胞系[38]中的研究结论一致。郭艳等[39]研究发现，TIM-3 在胃癌组织CD4+TIL 细胞中呈高表达状态，TIM-3 高表达可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进胃癌AGS 细胞增殖、侵袭，从而促进胃癌进展。淋巴细胞活化基因-3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）也是一种免疫检查点，作为T细胞稳态的负调节因子，常常表达于活化的CD4+、CD8+和NK 细胞，Chen BJ 等[40]将弥漫大B 细胞淋巴瘤细胞系与预置的T 细胞在抗LAG-3 和抗TIM-3的条件下共培养，观察发现肿瘤细胞死亡率呈剂量依赖性增加，验证了阻断TIM-3 或LAG-3 可以诱导CD8+T 细胞的抗淋巴瘤活性。总之，通过体外细胞功能实验同样证实，TIM-3 至少在多种常见肿瘤的进展中起一定的作用，TIM-3 可作为潜在的预后标记物。

2.7 动物实验 现已发现携带实体瘤的小鼠体内CD8+TIL 上可表达TIM-3，且同时表达PD-1。PD-1除了作为较早期被发现的免疫检查点之一并与其配体PDL-1 被广泛研究外，还被认为是慢性疾病中耗竭状态T 细胞的一种标记。有研究[41]分离荷瘤小鼠CD8+TIL，并在体外直接检测其分泌细胞因子的功能。结果发现，与TIM-3-PD-1+TIL 和TIM-3-PD-1-TIL 相比，TIM-3+PD-1+TIL 表现出最严重的衰竭状态，表现为不能增殖和产生IL-2、肿瘤坏死因子和干扰素-γ。已有研究发现[28]，在TIM3 过表达的Tgfbr1/Pten2cKO 头颈部鳞状细胞癌小鼠模型中，抗TIM-3 单抗可通过靶向CD4+TIM-3+细胞和CD8+TIM-3+细胞，减少髓系来源的抑制细胞，恢复效应T细胞功能，有效抑制肿瘤生长。曲美替尼作为一种丝裂原激活的细胞外信号调节激酶（MEK）抑制剂，已被证明对晚期黑色素瘤患者有效。Liu Y 等[42]将曲美替尼和抗TIM-3 单克隆抗体（MAb）联合治疗B16-F10 黑色素瘤小鼠，结果发现抗TIM-3 单抗可对抗MEK 抑制剂带来的促TIM-3 表达的作用，通过刺激CD8+T 细胞增强其抗肿瘤免疫功能。上述的动物实验无一不进一步说明TIM-3 在肿瘤免疫中起负性调节作用，TIM-3 靶向治疗不容忽视。

3 总结

在单种或多种不同实验技术方法联合检测下，TIM-3 的作用逐渐清晰，其在肿瘤免疫中的作用不可忽视。TIM-3 基因的多态性与肿瘤的发生发展有着一定的联系，TIM-3 表达（包括蛋白质、mRNA）更是涵盖多个系统常见恶性肿瘤，包括呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统、淋巴造血系统、神经系统等，其表达不限于CD4+T、CD8+T 细胞、NK 细胞等免疫细胞以及部分肿瘤细胞。在这些肿瘤中，TIM-3 往往处于高表达状态，通过诱导Th1 细胞凋亡，损害CD8+T细胞及NK 细胞免疫功能，以及与PD-1 共表达加重T 细胞“耗竭状态”等途径对抗肿瘤免疫。尽管目前依然存在一些争议，但越来越多的研究证实，TIM-3 的高表达往往是恶性肿瘤患者不良预后的重要因素之一，在未来TIM-3 有望成为评估肿瘤预后的新指标。