超声处理对芸豆蛋白理化性质及抗氧化能力的影响

周欣雨，佐兆杭，王 颖,2,3,4, ，么 杨 ，孙 维，张乃丹，庞惟俏

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319；2.国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江大庆 163319；3.粮食副产物加工与利用教育部工程研究中心，黑龙江大庆 163319；4.黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室，黑龙江大庆 163319；5.中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081）

随消费者生活方式和膳食结构的改变，植物性蛋白倍受青睐。研究发现增加植物蛋白有助于预防糖尿病、增强心肺功能和抑制肿瘤细胞。芸豆作为食用豆中的主要品种之一，种植范围广，成本低，广泛被应用于食品加工。芸豆的蛋白质含量丰富（23%），含脂量低，具有很高药用和保健价值，心脏病和高脂血症患者食用优选，且芸豆蛋白多肽的抗氧化活性较高，可提高机体免疫能力，抑菌和抗病功效突出。然而，因芸豆蛋白表面电荷低，水溶性差，导致蛋白质在水溶液中不稳定，使芸豆蛋白不能全面满足工业生产的需要。因此，利用绿色、环保的物理技术，来改变蛋白质的理化性质，从而提高人们对植物蛋白的利用率是十分必要的。

超声波技术被公认为一种实用高效的提取技术，与热工艺不同，超声波在食品蛋白行业的实施更简单、更快、更便宜，能耗更低，设备污染更低，操作条件更便利、无菌。随着超声处理产生的空化作用和机械作用，导致分子间键的断裂和重新形成，可降低液滴尺寸，提高乳液稳定性，改变蛋白质溶解度等，如改变豌豆蛋白、大豆蛋白的乳化性等性能，已广泛应用于食品工业。但目前豌豆蛋白、大豆蛋白的研究主要是超声对其理化及结构特性的影响，对蛋白质不同超声条件以及超声前后抗氧化能力鲜有报道。本研究以芸豆蛋白为原料，研究了超声处理对芸豆蛋白理化及抗氧化能力的影响，旨为拓宽芸豆蛋白的应用领域，为芸豆蛋白在相关功能性食品的研发与加工中提供理论依据及数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脱脂芸豆蛋白（蛋白质量分数90%） 三原天域生物制品有限公司；T-AOC 试剂盒、铁离子还原力试剂盒 上海博湖生物科技有限公司；5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）、乙二胺四乙酸 上海碧云天生物技术有限公司；甘氨酸 上海吉至生化科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷 天津光复科技发展有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 美国Sigma 公司；以上试剂 均为分析纯。

AR2140 电子天平 常州励岸宝机械设备科技有限公司；DL-360B 型超声波清洗机、FD-1A-50 型冷冻干燥机、JIDI-18D 型台式多用途高速离心机上海之信仪器有限公司；UV759 型紫外分光光度计爱来宝医疗科技有限公司；PHS-3C pH 计 上海精密科学仪器有限公司；NLM100 均质机 上海人和科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 超声处理芸豆蛋白样品的制备 参考Tomotake等的方法制备超声后芸豆蛋白样品，略有改动。20 g 芸豆蛋白粉溶解于100 mL 蒸馏水中并搅拌均匀，分别作用于不同超声功率（160、400 W），不同超声时间（10、20、30 min），样品为A、A、A、B、B、B。超声结束将样品平铺放入容器中，-80 ℃冰箱冻12 h 后通过冻干机干燥成粉末，于4 ℃冰箱密封保存。

1.2.2 芸豆蛋白水解度测定 利用邻苯二甲醛（OPA）法对芸豆蛋白进行水解度测定。用紫外可见光分光光度计测定其吸光度（340 nm），吸光度要在精准反应2 min 后测定。按照下列公式进行计算：

式中：0.9516 meqv/L：去离子水固定参数；OD：吸光度；h：水解的肽键数；h：总肽键数，（芸豆蛋白为7.42 mmol/g）；SerineNH：毫摩SerineNH/g 蛋白；X：待测样品重量（g）；P：待测样品浓度（g/mL）；、：分别用常数1.00、0.40 表示。

1.2.3 芸豆蛋白溶解度测定 取0.5 g 芸豆蛋白粉加入30 mL 去离子水，500 r/min 下搅拌1 h，8000 r/min离心15 min，取上清液，微量凯氏定氮法测定蛋白含量。溶解度为上清液中蛋白质含量占总蛋白质量浓度的百分比度。

1.2.4 芸豆蛋白游离巯基与二硫键含量测定 将10 mmol/L 5,5'-二硫代-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）溶解在0.1 mol/L Tris-甘氨酸缓冲液（2.5% SDS，0.004 mol/L EDTA，0.09 mol/L 甘氨酸，0.086 mol/L Tris，pH8.0）中得到Ellman’s 试剂。取50 μL DTNB 缓冲液与2 mL 浓度为0.01 g/mL 的样品溶液混合，25 ℃避光反应30 min。紫外分光光度计测定吸光度（412 nm），以缓冲液为空白，测定游离巯基含量。在测定总巯基含量时，将适量的蛋白质样品溶解于尿素-Tris-甘氨酸缓冲液（10 mol/L 尿素，2.5% SDS，0.004 mol/L EDTA，0.09 mol/L 甘氨酸，0.086 mol/L Tris，pH8.0）和-巯基乙醇（-Me；加入50 μL），摇匀后在25 ℃暗室孵育60 min。8000 r/min 离心20 min，将得到的上清溶于5 mL 浓度为12%的TCA（w/v）中，重复3 次。离心后将沉淀溶解于2.5 mL 的Tris-甘氨酸溶液中，加入50 μL DTNB，25 ℃避光孵育30 min。最后，用紫外分光光度计在412 nm 处测量吸光度。巯基含量的计算公式如下：

式中：A为样品在412 nm 处减去空白后的紫外吸光度值；D 为样品稀释倍数；C 为样品浓度（g/mL）；二硫键含量由总巯基含量减去游离巯基含量再除以二得到。

1.2.5 芸豆蛋白乳化性及乳化稳定性测定 乳化性及乳化稳定性的测定参考Wu 等报道的方法，用磷酸盐缓冲液溶液（0.1 mol/L，pH7.0）配制芸豆蛋白溶液，使蛋白的质量浓度为0.2%，蛋白溶液与大豆油的体积比为4:1，配置好溶液后，利用均质机使其形成乳状液（1000 r/min，1 min），均质液静止0 和10 min后从离心管底部0.5 cm 处取50 μL 浆液，并加入5 mL质量分数为0.1%的SDS 溶液中制成混合液，振荡混匀，在500 nm 处测定混合液吸光度。0 min 时混合液的吸光度值记为A，10 min 时混合液的吸光度值为A，以0.1%的SDS 溶液做空白对照，计算公式如下：

式中：θ 表示乳化液中的油相体积分数（25%）。

1.2.6 芸豆蛋白起泡性及起泡稳定性测定 配制100 mL 蛋白质量分数为5%的蛋白分散液，均质（8000 r/min，2 min），均质20 s 停顿20 s，然后快速转入量筒中，记录刚转入量筒的泡沫体积V，并分别记录在2、30 min 时泡沫的体积为V、V。

1.2.7 芸豆蛋白抗氧化能力测定

1.2.7.1 芸豆蛋白总抗氧化能力测定 取0.5 g 芸豆蛋白粉加入50 mL 去离子水中，混合均匀。采用TAOC 试剂盒测定。

1.2.7.2 芸豆蛋白DPPH 自由基清除能力测定 参考张雪春等的方法略有改动。乙醇为溶剂配制浓度为2×10mol/L 的DPPH 自由基溶液，于4 ℃冰箱保存备用。取0.5 mL 浓度为0.01 g/mL 样品溶液，加入4 mL DPPH 自由基溶液混匀，室温静置30 min。利用紫外分光光度计测定其吸光值A（517 nm）；同时取4 mL 2×10mol/L DPPH 自由基溶与0.5 mL 60%乙醇混匀，测定其吸光值A，计算公式如下:

1.2.7.3 芸豆蛋白铁离子还原能力测定 取0.5 g 芸豆蛋白粉加入50 mL 去离子水中，混合均匀。使用铁离子还原力试剂盒进行测定。

1.3 数据处理

实验均进行三次重复，结果以平均值±标准偏差表示。利用Excel、SPSS 22.0 等进行数据的处理和分析，采用Origin 2018 绘图。

2 结果与分析

2.1 超声处理对芸豆蛋白水解度的影响

超声处理对芸豆蛋白水解度的影响如图1 所示。与未处理组相比，芸豆蛋白水解度随着超声功率与时间的增加而提高，当超声时间20 min、功率400 W（B）时芸豆蛋白的水解度增强效果最显著（＜0.05），由3.34%增加至20.10%。分析是由于超声处理产生的空化效应改变了蛋白质结构，使包埋在蛋白质内部的活性部位暴露，增加了底物与活性部位的结合，使蛋白质水解度提高，这一结果与杜双奎等研究一致。但当超声功率不变，时间继续增加时（B），水解度开始下降，分析是由于超声时间过长，使芸豆蛋白暴露在外的与底物结合的活性部位被破坏，导致水解度开始降低。

图1 不同超声条件对芸豆蛋白水解度的影响Fig.1 Effects of different ultrasonic conditions on protein hydrolysis degree of kidney bean

2.2 超声处理对芸豆蛋白溶解度的影响

溶解度是蛋白质的重要性质之一。如图2 所示，当超声时间10 min、功率160 W（A）时，芸豆蛋白溶解度变化并不显著（＜0.05），在A（20 min，160 W）至B（20 min，400 W）时，芸豆蛋白溶解度随着超声时间及功率的增加而显著提高（＜0.05），在B时蛋白溶解度达到最大值79.43%。超声产生的空化作用与机械效应可将蛋白质聚集体颗粒发生解聚现象，使蛋白质聚集体粒径降低，增强蛋白质与水相互作用，从而增加蛋白质溶解度。当超声功率不变，时间继续增加时（B），蛋白质溶解度发生下降现象，分析是超声时间过长导致蛋白质的解聚体重新聚集，溶解度减小。Zhong 等指出，在不同温度和时间加热时对绿豆蛋白的溶解度影响不大；相反，在热与超声共同作用下，随处理温度和时间增加，蛋白质溶解度逐渐增加，由此超声也被认定是蛋白质溶解度增加的主要原因。

图2 不同超声条件对芸豆蛋白溶解度的影响Fig.2 Effects of different ultrasonic conditions on protein solubility of kidney bean

2.3 超声处理对芸豆蛋白游离巯基与二硫键含量的影响

图3 表示了不同超声强度处理芸豆蛋白中游离巯基与二硫键含量的变化。由图3 可知，随超声强度增加，蛋白中游离巯基的含量显著提高（＜0.05），二硫键的含量显著降低（＜0.05）；与未处理组相比，超声时间20 min、功率400 W（B）时游离巯基的含量最高、二硫键含量最低，分别由3.95 μmol/g 增加至7.45 μmol/g、由2.91 μmol/g 减少至1.31 μmol/g。分析是因超声使蛋白质分子颗粒减小，进而内部机构发生了改变。Hu 等研究表明，超声处理会破坏蛋白质内二硫键，分解成新游离巯基。因此，本实验中超声处理使蛋白质内部的巯基暴露与二硫键的断裂，降低了蛋白质分子的稳定性，从而使芸豆蛋白的游离巯基的含量增加与二硫键的减少。但在当超声功率不变时间延长时，蛋白中游离巯基的含量变少，二硫键含量增多，分析是蛋白质所含游离巯基在长期暴露于极性环境中易与二硫键重新结合，导致游离巯基的减少与二硫键增多。

图3 不同超声条件对芸豆蛋白游离巯基与二硫键含量的影响Fig.3 Effects of different ultrasonic conditions on content of freegroup and disulfide bond in kidney bean protein

2.4 超声处理对芸豆蛋白乳化性及乳化稳定性的影响

乳化性是指超声通过改变蛋白质的二级结构，使之部分变性，从而暴露疏水基团使之相互作用解离，促进分子在小颗粒表面扩散，从而更好地吸附油水界面上的油滴，乳化稳定性越高，则表示乳化性质越好。如图4 所示，超声后芸豆蛋白的乳化及乳化稳定性显著增加（＜0.05），超声时间10 min、功率400 W 时芸豆蛋白的乳化性最佳，由2.66 m/g 增加至5.49 m/g，乳化稳定性最好，由51.68%增加至70.11%，但当超声功率不变，时间继续增加时，乳化及乳化稳定性开始下降。这是由于超声时间过长会使蛋白质严重变性，蛋白质小颗粒重新聚集成大颗粒从而降低了乳化性。大量研究发现，超声处理可以有效地改善蛋白质的乳化性及乳化稳定性等功能性指标。

图4 不同超声条件对芸豆蛋白乳化性及乳化稳定性的影响Fig.4 Effects of different ultrasonic conditions on sulfhydryl emulsification and stability of kidney bean protein

2.5 超声处理对芸豆蛋白起泡性及起泡稳定性的影响

由图5 可知，超声处理对芸豆蛋白起泡性及起泡稳定性差异显著（＜0.05），在超声时间10 min、功率400 W 时芸豆蛋白的起泡性和起泡稳定性达到最大值，分别由88.13%增加至162.81%，由65.24%增加至72.94%。分析是超声波产生的空化作用使芸豆蛋白分子聚集程度降低，蛋白质疏松，从而芸豆蛋白更容易吸附在气-水界面上，增加了芸豆蛋白的起泡性及起泡稳定性。望运滔等研究，随超声强度增加，鹰嘴豆蛋白的起泡性显著增强（＜0.05），超声处理20 min 时，达到最大值136.7%，是未处理组的2.3 倍。但当超声功率不变、时间延长时，芸豆蛋白的起泡性及起泡稳定性数值下降，这是由于超声时间过度，蛋白质疏松结构变得紧密，使起泡性及起泡稳定性出现降低的现象。因此，适当的超声处理能够有效的提高芸豆蛋白的起泡性及起泡稳定性。

图5 不同超声条件对芸豆蛋白起泡性及起泡稳定性的影响Fig.5 Effects of different ultrasonic conditions on foamability and foamability stability of kidney bean protein

2.6 超声处理对芸豆蛋白抗氧化能力的影响

芸豆蛋白的抗氧化能力如图6 所示。由图6 可知，超声处理前后蛋白抗氧化能力差异显著（＜0.05），在超声时间10 min、功率400W（B）时，芸豆蛋白总抗氧化能力、DPPH 自由基清除能力与Fe 离子还原能力分别达到最大值，总抗氧化能力由323.60 U/mL增加到636.28 U/mL；DPPH 自由基清除能力由49.70%增加至87.28%；Fe 离子还原能力由62.74%增加至80.58%。研究人员发现超声处理会加速蛋白质疏水性氨基酸外露，使蛋白质疏水性与水解度增加，而蛋白质的抗氧化能力与疏水性与水解度成正比。由此说明，超声处理增加蛋白质的疏水性与水解度，从而增加了芸豆蛋白的抗氧化能力。这也与上述试验中水解度增加的趋势相符。当超声功率不变，时间继续增加时，蛋白的三种抗氧化能力指标数值开始下降，分析是超声时间过长，暴露氨基酸基团重新被掩埋，水解度下降，继而抗氧化能力降低。

图6 不同超声条件对芸豆蛋白抗氧化能力的影响Fig.6 Effects of different ultrasonic conditions on antioxidant capacity of kidney bean protein

3 结论

与未处理组相比，超声处理显著提高（＜0.05）芸豆蛋白的溶解度、水解度、乳化性及乳化稳定性、起泡性及起泡稳定性，超声处理使芸豆蛋白游离巯基含量增加，二硫键含量减少。超声处理提高了芸豆蛋白抗氧化能力，总抗氧化能力、DPPH 自由基清除能力与Fe 离子还原能力三种指标数据均显著提高（＜0.05）。但超声时间过长也会引发芸豆蛋白的理化性质数值与抗氧化能力下降，因此，适度超声处理可以提高芸豆蛋白理化性质及抗氧化能力。