福建光皮树优树EST-SSR标记开发与遗传多样性

叶代全

(福建省洋口国有林场，福建 顺昌 353211)

光皮树(Cornuswilsoniana)又名光皮梾木，是山茱萸科(Cornaceae)梾木属植物，是我国特有的多用途木本油料树种，分布于中国长江流域至西南各地的石灰岩山区[1-3]。光皮树果油不仅可以作为高级食用油，而且具有显著的降胆固醇、减肥等药用和保健价值[1，4-10]。2013年12月，国家卫生和计划生育委员会正式批准光皮树果实油为我国的新食品原料。光皮树在城市绿化、丘陵和荒山营造生态经济林以及石漠化地区的生态恢复起到重要作用[3，11-12]。

本研究于2013年11月对闽西北地区(主要在明溪县、将乐县和宁化县境内)光皮树的分布情况进行调查，收集闽西北地区的光皮树种质资源(优树)24份，采集11个优树的种子并进行子代测定[1]。由于福建处于中国光皮树自然分布区的边缘，显然从种质资源保护的角度这些优树具有重要价值。然而这些优树的遗传多样性水平、福建光皮树种群与国内其它地区光皮树种群之间的遗传距离等未见报道。

分子标记是在 DNA水平上反应不同个体或种群间的遗传多样性。相比其它的遗传标记，DNA分子标记不易受环境影响，可靠性更高，可以快速、准确地对植物遗传多样性进行研究。EST-SSR是基于表达序列标签(Expressed Sequence Tag)开发的SSR分子标记[13]，与基因组SSR相比，EST-SSR可以在物种之间转移。目前，EST-SSR已被广泛应用于植物遗传多样性评价、种质鉴定研究等。本研究采用转录组技术，开发光皮树EST-SSR分子标记，并利用这些标记对福建省11个优树种质资源进行遗传多样性相关研究，以期为光皮树的种质资源收集保存及遗传育种提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验地概况

光皮树材料来自福建省洋口国有林场的光皮树优树子代测定林，共11个优树子代。其中9个来自明溪(MX)，1个来自宁化(NH)，1个来自将乐(JL)。

试验地位于福建省洋口国有林场元峰工区3林班3大班2小班，地理位置为东经117°41′、北纬27°4′，南坡，坡度24°，海拔329 m。小班面积为10.2 hm2，其中试验地面积为1.3 hm2。造林地前茬属杉木林地，土壤为红壤，立地等级Ⅱ级。

1.2 试验方法

1.2.1 样本采集、处理与DNA提取 2020年4月，在福建省洋口国有林场的光皮树优树子代测定林采集11个优树子代新鲜叶片，每个样本标号后装入自封袋中，放入装有干冰的泡沫盒带回实验室，将样品置于-80 ℃的超低温冰箱中备用。各样本DNA提取采用QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit(50)植物DNA提取试剂盒；采用1%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA 检测，带型清楚整齐、无拖尾等现象表示提取结果较佳；结合紫外分光光度计、Qubit荧光计检测DNA纯度与浓度。

1.2.2 光皮树EST-SSR位点检索 对项目组前期开展的光皮树不同组织转录组测序数据，采用MISA软件检索重复单元在3～5 bp的微卫星位点，重复次数大于5次。

1.2.3 光皮树EST-SSR引物设计 采用PRIMER3软件，对上述检索结果依据扩增产物区段在100～300 bp，最小TM值为55 ℃和最优TM值为57 ℃的设计原则，共开发了200对EST-SSR引物。

1.2.4 光皮树EST-SSR引物合成与多态性引物筛选 采用加尾法进行荧光引物合成，再随机选取8份光皮树DNA，对200对引物经过初筛和复筛，共选出29对多态性好、稳定性高的有效引物；采用29对引物(表1)对全部11个样本DNA 进行PCR扩增。

表1 用于光皮树种质资源分析的29对EST-SSR 引物序列信息

表1(续)

1.2.5 光皮树EST-SSR PCR扩增、检测 光皮树EST-SSR PCR扩增反应在ABI PCR扩增反应仪上进行。PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃修复延伸5 min；35次循环。

图1 光皮树样本EST-SSR引物PCR扩增毛细管电泳图

PCR产物使用ABI 3730 测序仪进行毛细管电泳检测(图1)，结合分子内标来分析片段大小，测序仪检测结果采用Gene mapper 3.0软件分析。

1.2.6 光皮树EST-SSR数据及分析 根据荧光检测的峰值得到片段大小信息，按样本和引物制备EST-SSR扩增产物大小矩阵，用于遗传多样性分析。应用GenAlEx 6.51b2软件分析得到各微卫星位点的基因频率、特有多态位点、Shannon 信息指数和基因多样性指数等。

2 结果与分析

2.1 福建省光皮树优树EST-SSR标记的多态性

采用经2轮筛选的29对光皮树EST-SSR多态引物对福建省11个光皮树优树材料进行分析，共扩增出90个EST-SSR位点，平均多态性位点占55.17%。29对引物的有效多态位点数变幅为0.333(M1)～3.195(M3)。29对引物的Shannon 信息指数变幅为0.0000(M1，M13)～1.068(M3)，平均值为0.426。说明筛选出的EST-SSR引物在11个光皮树优树种质资源材料间存遮丰富的遗传多样性(表2)。从优树采集地点上看，来自明溪的光皮树优树多态性位点比例为93.10%，宁化为27.59%，将乐为44.86%。

表2 光皮树29对EST-SSR标记的多态性分析

2.2 福建省光皮树优树EST-SSR遗传多样性

对来自福建省3个地点的11株优树的EST-SSR标记进行F统计量及有效种群大小参数Nm估算，结果见表3。从Fst可以看出，29个EST-SSR标记的遗传分化指数平均值为0.498，说明目前收集的福建省11株优树群体具有较好的遗传多样性。群体特有等位基因数量分析结果表明：11个优树共发现51个特有等位基因，占56.67%。其中，来自明溪的有45个，宁化的有1个，将乐的有5个。

表3 光皮树各位点F统计量和Nm的估计值

2.3 光皮树优树EST-SSR主坐标分析

从全国8个光皮树种群EST-SSR分子标记主坐标PCoA分析结果可知，前3个主成分解释变异的累积百分率分别为42.52%、66.39%、83.09%。二维PCoA分析(图2)明显将各群体划分为3大类(湖南、湖北、贵州、江西、重庆和广东为一类，福建和广西各自为一类)。其中广西的分布与其它群体相距最远，福建次之，的确位于全国光皮树分布区的边缘。PCoA分析结果大致表现出光皮树种质资源在分布上的地域规律性。

2.4 光皮树优树EST-SSR特有等位基因分析

在来自重庆、江西、湖南、湖北、贵州、广西、广东和福建等全国8个光皮树种群综合分析中，全部275个优树群体中共获得124个特有等位基因。其中，来自福建的有11个，占8.87%；而且来自福建省的11个优树个体每个个体均含有特有等位基因(表4)。

GZ为贵州；HB为湖北；HN为湖南；GD为广东；JX为江西；GX为广西；FJ为福建；CQ为重庆 图2 光皮树群体的PCoA分析

3 结论与讨论

3.1 结论

本研究利用光皮树转录组测序数据开发了光皮树EST-SSR分子标记，并筛选出了29对多态引物，来自福建省11个优树子代共扩增出90个EST-SSR位点，平均多态性位点占55.17%；来自明溪的光皮树优树多态性位点比例为93.10%，宁化为27.59%，将乐为44.86%。福建省11个光皮树优树个体间遗传分化指数平均值为0.498，11株优树中共发现51个特有等位基因，占56.67%。全国8个光皮树种群275株优树中共获得124个特有等位基因，其中来自福建的有11个，占8.87%；且11株优树每株均含有特有等位基因。

3.2 讨论

油脂既是人们生活必需的消费品，又是食品、医药、皮革、纺织、化妆和油漆等工业的重要原料。维护粮油安全一直是世界各国高度关注的重大战略。我国在大豆和油菜籽方面一直是净进口国，进口量也呈持续增加态势。我国油料净进口量由2000年的1260万t增加到2017年的1亿t，2020年油料净进口量为1.04亿t，较上年增加12.8%。大豆净进口量占我国油料净进口总量的比例一直在90%以上，2020年达到96.5%，净进口总量达到1亿t。

目前，我国食用植物油构成以大豆油、棕榈油和菜子油为主，以茶油为主的木本植物油只占年总量的1.8%左右。联合国粮农组织已将木本油料列为重点推广的健康型高级食用油。发展木本油料产业，有利于维护国家粮油和能源安全。维护粮油安全一直是世界各国高度关注的重大战略。长期以来，党中央、国务院始终把粮油生产放在突出位置，采取一系列有力措施，确保粮食连年增产，创造了用占世界9%的耕地资源养活占世界21%人口的奇迹，但是，保障国家粮油安全依然面临严峻的挑战。

表4 福建省光皮树优树特有等位基因及频率

在世界面临能源危机的今天，可再生的生物质能源越来越受到人们的重视，成为世界能源战略调整重要的发展方向。木本油料是优质食用植物油及可再生的生物质能源，加快木本油料产业发展，有利于保障国家粮油市场供应，确保国家油料和能源安全。光皮树是我国特有的木本油料植物，除作为油料植物栽培，还在园林绿化得到广泛应用，尤其是能够在石灰岩山地生长，近年来得到这些地区领导和企业家的密切关注，作为生态林来建设的同时，能够产生经济效益，目前正受到重视。在适宜地区进行光皮树的推广种植将是未来我国木本油料产业发展过程中的必然趋势。

福建省虽然是我国光皮树分布的边缘产区，但从前期开展的光皮树种质资源调查中发现，福建省仍存在一定数量的古树，根据当地农民口述估计，均约在100 a 以上，大多位于风景名胜区[3]。因此，在历史上福建省很有可能存在原始光皮树种群，因本次获得的福建省光皮树优树数量有限，不同群体的数量差异较大，很多遗传参数无法估算。但从本项研究的结果还是能够看出，福建省的光皮树优树的遗传多样性较高，尤其是获得较高比例的特有等位基因，超过一半，占56.67%。来自将乐风景区的1株优树上含有5个特有等位基因，说明这些种质资源非常值得保护和收集。从建设全国光皮树种质资源库的角度来看，来自福建省的光皮树种质资源是不可缺少的重要部分。今后应加强福建省光皮树种质资源的收集、保护和开发利用等方面的基础和应用研究。