丙戊酸钠对严重烫伤合并海水浸泡延迟补液模型大鼠心脑损伤的保护作用Δ

孟祥熙，田雨沫，胡森，王莉莉，张慧苹，钟毓贤，王宏伟，丁宇（.承德医学院附属医院烧伤整形科，河北 承德 067000；.解放军总医院医学创新研究部创伤修复与组织再生研究中心，北京 008；.解放军总医院第六医学中心中医医学部康复医学科，北京 0008；.解放军总医院第四医学中心病理科，北京 0007；.解放军总医院第六医学中心中医医学部骨伤科，北京 0008）

随着人类海洋活动的增加，海难或海战时落海伤员常同时伴有烧伤和海水浸泡。由于海上环境特殊，医疗救助受限，往往难以及时开展有效的静脉液体复苏，导致伤员死亡率升高，救治难度增加[1]。若在伤后早期给予抗休克维持药物，提高机体对休克的耐受能力，保护心脑等重要脏器功能，就能为后续救治争取时间，从而提高伤员生存率。丙戊酸钠是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，既往研究发现，在失血性休克或致死性烫伤动物实验中，丙戊酸钠能保护重要脏器功能，提高动物生存率[2－5]。因此，本研究通过构建严重烫伤合并海水浸泡延迟补液大鼠模型，并在烫伤后立即皮下注射大剂量丙戊酸钠，从而探究其对大鼠损伤心脑的保护作用，以期为丙戊酸钠用于烧伤合并海水浸泡伤员的救治提供实验依据。

1 材料

1.1 主要仪器

PowerLab型多导生理记录仪购自澳大利亚ADInstruments公司；RAPIDPoint 500型血气分析仪购自德国Siemens公司；KD-BM型生物组织包埋机购自金华市科迪仪器设备有限公司；CKX53型倒置显微镜购自日本Olympus公司；ST360型酶标仪购自上海科华生物工程股份有限公司；数字测温仪购自衡水创纪仪器仪表有限公司。

1.2 主要药品与试剂

丙戊酸钠对照品（批号B2013169，纯度≥98%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；戊巴比妥钠（批号P3761，纯度≥98%）购自美国Sigma公司；乳酸钠林格注射液（批号2010242107，规格500 mL）购自石家庄四药有限公司；肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB）和神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）酶联免疫吸附测定试剂盒（批号分别为202107、202104）均购自上海江莱生物科技有限公司。

1.3 人工海水

人工海水按照国家海洋局第三海洋研究所提供的海水主要成分配制，其渗透压为（1 250±11）mmol/L，pH为8.20，含钠离子（630±5）mmol/L、钾离子（10.88±0.68）mmol/L、氯离子（658.8±5.5）mmol/L，温度为（23±1）℃。

1.4 动物

雄性SD大鼠180只，60～70日龄，体质量250～300 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，生产许可证号为SCXK（京）2019-0010。购进后，大鼠适应性饲养于22～25℃的饲养房内1周以上，自由饮食。大鼠饲养与实验过程均严格遵守实验动物管理与保护准则。

2 方法

2.1 分组、造模与给药

将大鼠按照随机数字表法分为烫伤+延迟补液组（S组）、烫伤+海水浸泡+延迟补液组（SS组）、烫伤+海水浸泡+丙戊酸钠+延迟补液组（SSV组），每组60只。术前禁食12 h、自由饮水，所有大鼠称定体质量后给予戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，固定、消毒，解剖分离一侧颈总动脉、静脉，分别插管，剪除颈背部和臀部毛发。采用沸水水浴法建立Ⅲ度烫伤模型：将大鼠颈背部和臀部浸泡于100℃沸水中15 s造成35%总体表面积Ⅲ度烫伤，烫伤深度经病理组织切片检查证实。SS组和SSV组大鼠烫伤后立即浸泡于人工海水中（30 min），其中SSV组出水后即刻皮下注射丙戊酸钠300 mg/kg[6－7]。烫伤后2 h，各组按1/2 Parkland公式（4 mL×1%烧伤面积×kg）于30 min内静脉注射乳酸钠林格注射液进行延迟补液，在烫伤后的第1个8 h补入总量的1/2[8]。

2.2 大鼠生存情况观察

每组取20只大鼠。S组烫伤后即刻观察，SS组和SSV组海水浸泡后开始观察，每30 min观察1次，连续观察24 h，记录大鼠死亡时间，计算各组大鼠平均生存时间和24 h生存率。24 h生存率（%）＝（各组大鼠烫伤后24 h生存只数/各组总只数）×100%。

2.3 大鼠生命体征检测

每组分别在烫伤前、烫伤后0 h、烫伤后2 h、烫伤后5 h这4个时间点取10只大鼠，采用多导生理记录仪检测大鼠的平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）、心率（heart rate，HR）、呼吸频率（respiration rate，RR），采用数字测温仪插入大鼠肛门10 cm处检测其直肠温度（rectal temperature，RT）[9]。

2.4 大鼠动脉血气和脏器功能指标检测

抽取“2.3”项下各组同批次大鼠4个时间点的颈动脉血，采用血气分析仪检测血气分析指标，包括pH、动脉血氧分压（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）、动脉血二氧化碳分压（arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2）、实际碳酸氢根（HCO3－）；将抽取的颈动脉血离心后取血清，按照试剂盒说明书操作以酶标仪检测血清中CK-MB、NSE水平。

2.5 大鼠心脏、脑组织病理观察

抽血后，将“2.4”项下各组同批次大鼠处死，每只大鼠取相同位置心脏、脑组织各1块，使用10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋、切片（5 μm），常规苏木精-伊红（HE）染色后，于倒置显微镜下观察并拍照。

2.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件分析数据。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存曲线比较采用Log-rank检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 大鼠平均生存时间及24 h生存率检测结果

S组大鼠的平均生存时间为（1 424.5±10.68）min，24 h生存率为90%；SS组大鼠的平均生存时间为（972.05±128.52）min，24 h生存率为55%；SSV组大鼠的平均生存时间为（1 240.80±84.66）min，24 h生存率为75%。与S组大鼠比较，SS组大鼠24 h生存率显著降低（P＜0.05）；与SS组大鼠比较，SSV组大鼠24 h生存率显著升高（P＜0.05）。结果见图1。

图1 各组大鼠24 h生存曲线图

3.2 大鼠生命体征检测结果

与S组比较，SS组大鼠烫伤后0、2、5 h的MAP、RT、HR和烫伤后0、2 h的RR均显著降低（P＜0.05）；与SS组比较，SSV组大鼠烫伤后2、5 h的MAP、RT、HR和烫伤后2 h的RR均显著升高（P＜0.05）。结果见表1（表中，1 mmHg＝133.322 Pa）。

表1 各组大鼠生命体征检测结果（±s，n＝10）

表1 各组大鼠生命体征检测结果（±s，n＝10）

a：与S组比较，P＜0.05；b：与SS组比较，P＜0.05

指标MAP/mmHg RT/℃RR/（次/min）HR/（次/min）烫伤前126.2±5.5 127.1±6.9 125.5±7.8 36.8±0.6 36.7±0.7 36.7±0.5 95.7±4.6 94.6±5.9 96.0±5.8 435.2±40.7 431.2±45.0 443.9±34.3组别S组SS组SSV组S组SS组SSV组S组SS组SSV组S组SS组SSV组烫伤后0 h 125.5±6.9 109.1±11.8a 108.7±10.8 36.6±1.4 27.1±1.1a 27.2±1.1 93.1±7.7 81.9±5.1a 82.1±4.6 444.1±30.9 355.1±28.6a 351.2±31.2烫伤后2 h 123.4±6.8 92.4±13.4a 111.2±7.9b 35.2±1.2 28.2±1.8a 29.9±0.9b 87.1±3.4 80.7±10.2a 82.9±12.8b 369.8±24.0 310.6±35.7a 347.7±30.1b烫伤后5 h 126.3±6.9 98.8±14.1a 114.3±13.1b 35.7±1.4 30.5±1.7a 32.2±1.6b 92.4±8.6 92.7±7.5 90.9±5.8 405.8±32.1 334.0±37.6a 381.2±56.4b

3.3 大鼠动脉血气和脏器功能指标检测结果

与S组比较，SS组大鼠烫伤后0、2、5 h的动脉血pH、PaO2、HCO3－均显著降低（P＜0.05），血清CK-MB、NSE水平均显著升高（P＜0.05），烫伤后2、5 h的动脉血PaCO2显著升高（P＜0.05）；与SS组比较，SSV组大鼠烫伤后2、5 h的pH、PaO2、HCO3－均显著升高（P＜0.05），CK-MB、NSE水平和PaCO2均显著降低（P＜0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠动脉血气和脏器功能指标检测结果（±s，n＝10）

表2 各组大鼠动脉血气和脏器功能指标检测结果（±s，n＝10）

a：与S组比较，P＜0.05；b：与SS组比较，P＜0.05

指标pH PaO2/mmHg PaCO2/mmHg HCO3－/（mmol/L）CK-MB/（U/L）NSE/（ng/mL）烫伤后5 h 7.37±0.03 7.26±0.04a 7.35±0.07b 124.9±7.8 112.9±7.1a 121.9±7.3b 38.5±3.7 46.0±3.3a 42.6±3.0b 17.8±2.9 13.6±2.9a 16.9±2.6b 1 045.5±78.3 1 907.8±192.5a 1 540.5±190.4b 9.7±1.7 15.2±2.1a 11.8±2.2b组别S组SS组SSV组S组SS组SSV组S组SS组SSV组S组SS组SSV组S组SS组SSV组S组SS组SSV组烫伤前7.38±0.02 7.39±0.03 7.40±0.04 127.9±7.2 128.1±7.8 128.1±7.4 35.5±3.2 35.3±3.8 35.3±3.6 22.9±2.7 22.2±3.6 22.9±3.4 626.7±51.5 625.2±65.6 625.7±66.4 7.5±1.1 7.6±1.2 7.5±1.1烫伤后0 h 7.31±0.04 7.24±0.07a 7.25±0.07 120.7±7.0 114.7±7.5a 114.1±7.1 37.6±3.5 38.2±2.8 38.3±2.5 17.5±2.0 14.5±2.2a 14.6±1.9 625.1±46.8 751.7±94.5a 757.7±74.6 7.5±1.7 13.2±2.8a 13.2±2.7烫伤后2 h 7.29±0.03 7.18±0.05a 7.27±0.08b 116.9±6.8 101.7±7.3a 108.8±6.5b 39.3±3.8 47.6±3.4a 43.9±3.1b 16.1±1.7 12.1±1.4a 13.8±1.8b 728.3±68.5 1 411.2±163.6a 1 197.2±195.8b 8.3±1.9 17.2±2.3a 13.8±2.1b

3.4 大鼠心脏、脑组织病理观察结果

HE染色结果显示，各组大鼠烫伤前心脏、脑组织结构完整清晰，细胞排列紧密，无水肿。在烫伤后2、5 h，大鼠心脏、脑组织间隙增宽，细胞肿胀，排列紊乱，且随着时间的延长，损伤程度逐渐加重。其中，SS组大鼠心脏、脑组织损伤程度较S组明显加重；而与SS组比较，SSV组大鼠心脏、脑组织损伤程度明显减轻。结果见图2、图3。

图2 各组大鼠心脏组织病理显微图（HE染色，×400）

图3 各组大鼠脑组织病理显微图（HE染色，×400）

4 讨论

海水具有低温、高渗透压、高致病菌等特点，海水浸泡后易造成机体体温降低、高渗性脱水、血流动力学紊乱、凝血功能障碍、心脑等重要脏器功能受损[10－13]。严重烧伤会导致大面积皮肤保护屏障受损，且海水浸泡会加剧创面渗出及组织脱水，增加休克的严重程度和组织的缺血缺氧性损害[14]。

丙戊酸钠是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，在临床上常用于治疗癫痫。既往研究发现，丙戊酸钠能改善失血性休克和烫伤模型大鼠的心、脑、肺、肠等脏器功能，抑制炎症反应，降低血管通透性[6－7，15－17]。本研究通过建立35%总体表面积Ⅲ度烫伤合并海水浸泡延迟补液大鼠模型来研究丙戊酸钠对大鼠心脑损伤的保护作用，结果显示，大鼠单纯烫伤后24 h生存率为90%，烫伤后海水浸泡24 h生存率降低至55%，证实严重烫伤合并海水浸泡会提高病死率；而给予丙戊酸钠治疗后，大鼠24 h生存率提高至75%，平均生存时间显著延长。CK-MB和NSE是反映心脏和脑组织损伤的重要标志物[18－19]，本研究中，SS组和SSV组大鼠烫伤后0、2、5 h的CK-MB、NSE水平均较S组显著升高；给予丙戊酸钠治疗后，在烫伤后2、5 h，CK-MB、NSE水平均较SS组显著降低。这提示在严重烫伤合并海水浸泡延迟补液的治疗过程中，海水浸泡后即刻给予丙戊酸钠治疗，能提高大鼠烫伤后早期生存率，延长其生存时间，保护其心脑功能。

海水浸泡后引起大鼠中心温度降低、血压及HR下降、呼吸抑制、循环功能紊乱，合并严重烧伤时，损伤程度进一步加重[9，20]。在本研究中，烫伤合并海水浸泡后大鼠RT、RR、MAP、HR均显著降低，随烫伤后时间延长及延迟补液，其烫伤后5 h的RT、MAP、HR仍低于S组，证实烫伤合并海水浸泡后机体损伤程度较单纯烫伤更加严重，生命体征更加不平稳；给予丙戊酸钠治疗后，在烫伤后2、5 h，大鼠RT、MAP、HR均较SS组显著升高，表明丙戊酸钠有助于烫伤大鼠血流动力学的稳定，并可维持其基本生命体征平稳，增加其对休克的抵抗能力。

严重烧伤易导致低血容量性休克、组织和器官灌注不足、细胞缺血缺氧、酸碱代谢产物失衡[21]。本研究发现，与S组比较，SS组烫伤后0、2、5 h的pH、PaO2、HCO3－显著降低，烫伤后2、5 h的PaCO2显著升高，表明海水浸泡会加重烫伤后缺血缺氧性损害，酸性代谢产物增多；给予丙戊酸钠治疗后，SSV组大鼠烫伤后2、5 h的pH、PaO2、HCO3－均较SS组显著升高，PaCO2显著降低，表明丙戊酸钠在严重烫伤合并海水浸泡延迟补液模型大鼠中，能改善其细胞缺血缺氧状态，维持酸碱平衡和内环境稳定。病理结果提示，各组烫伤后2、5 h的心脏和脑组织间隙增宽，细胞肿胀，结构紊乱，随伤后时间延长，组织损伤越重；在烫伤后2、5 h，SS组损伤程度较S组明显加重，而SSV组损伤程度较SS组明显减轻，表面丙戊酸钠能减轻严重烫伤合并海水浸泡延迟补液大鼠心脑损伤，维持其正常结构，保护其心脑功能。

综上所述，丙戊酸钠能延长严重烫伤合并海水浸泡延时补液模型大鼠的生存时间，提高其生存率，保护其心脑功能，改善其细胞缺血缺氧状态，提高其机体抗休克能力。但由于烫伤合并海水浸泡机制复杂，具体作用机制有待进一步深入探究。