抗宫炎软胶囊的质量标志物分析Δ

袁敏艳，张敏，张硕，曹思源，2，季嘉城，2，王鹏娇，张荣平，高秀丽，2#（.省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室/贵州医科大学药学院，贵阳 550025；2.贵州医科大学微生物与生化药学工程中心，贵阳 550025；.贵州医科大学实验动物中心，贵阳 550025；.昆明医科大学药学院，昆明 650500）

抗宫炎软胶囊（Kanggongyan soft capsule，KSC）是由抗宫炎片更改剂型而来的中药第九类新药，包含广东紫珠、乌药、益母草3味中药[1]。其中，广东紫珠具有抗炎、止血、抗结核和抗血小板聚集的作用[2]；乌药具有促进循环、止痛和散寒的作用[3]；益母草可用于治疗痛经经闭、恶露不尽、月经不调等妇科疾病[4]。KSC在临床主要用于治疗慢性宫颈炎、慢性盆腔炎、宫颈柱状上皮异位等妇科疾病。

对于KSC的质量控制研究，目前多集中于对其中单一成分的含量测定[5－6]。中药成分种类多、作用靶点多，以任何单一成分作为指标都不能全面反映中药的整体质量[7]。为确保中药及中药制剂发挥稳定的治疗效果，需要对其进行合理的质量控制。中药指纹图谱是一种能够全面反映中药或中药制剂整体化学特征的质量分析方法[8]，被广泛应用于中药及中药制剂的质量控制。近年来，超高效液相色谱（UPLC）法因其灵敏度高、操作方便等优点被广泛用于中药及中药制剂的质量控制[9]。网络药理学可整合大量信息，通过计算并结合相关实验，揭示“药物-基因-靶点-疾病”相互作用的网络关系[10]。分子对接技术可以模拟药物活性成分治疗疾病的过程，具有快速、准确等优点，有助于缩短药物开发周期[11]。网络药理学与分子对接的结合已成为中药研究的常用方法[12]。因此，本研究将指纹图谱、含量测定、网络药理学及分子对接技术相结合，分析KSC的潜在质量标志物（quality marker，Q-marker），以期为KSC的质量控制及后续研究提供科学参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有Agilent 1290型UPLC仪（美国Agilent公司）、TB-215型电子天平（美国Denver Instrument公司）、KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、WP-UP-YJ-20型纯水仪（四川沃特尔水处理设备有限公司）等。

1.2 主要药品与试剂

广东紫珠干浸膏（批号200601）、益母草干浸膏（批号200601）、乌药干浸膏（批号200501）均由贵州汇正制药有限责任公司提供；去甲异波尔定对照品（批号P10M9L61140）、盐酸益母草碱对照品（批号R04N8F-47273）、连翘酯苷B对照品（批号R14N9F74963）、金石蚕苷对照品（批号H29M3X1）、毛蕊花糖苷对照品（批号W14O10C100217）、异毛蕊花糖苷对照品（批号W17J10C90785）均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均不低于98%。KSC（批号分别为200101、200102、200303、200501、200502、200503、200504、200602、200603、200701、200702、200704、200705、200801、200805、200806、200902、200903、201001、201002，规格每粒装0.65 g，编号依次为S1～S20）均由贵州汇正制药有限公司提供。乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 UPLC指纹图谱分析

2.1.1 混合对照品溶液的制备 精密称取去甲异波尔定、盐酸益母草碱、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蚕苷、异毛蕊花糖苷对照品各适量，置于同一10 mL量瓶中，加50%甲醇使溶解，稀释至刻度，摇匀，制成上述对照品质量浓度分别为0.052、0.175、0.150、0.146、0.168、0.175 mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取KSC内容物约1.0 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，回流1 h，放冷，再次称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.1.3 色谱条件 色谱柱为CAPCELL PAK C18IF2（100 mm×2.1 mm，2 μm）；以乙腈（A）-0.5%磷酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～20 min，88%B→83%B；20～35 min，83%B→65%B；35～37 min，65%B→10%B；37～40 min，10%B→88%B）；流速为0.2 mL/min；柱温为35℃；进样量为2 μL；检测波长在0～10 min时为280 nm，10～40 min时为332 nm。

2.1.4 精密度试验 精密称取KSC内容物（编号S4），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.3”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。以5号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.00%（n＝6），相对峰面积的RSD均小于5.00%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.1.5 重复性试验 精密称取KSC内容物（编号S4），按“2.1.2”项下方法平行制备供试品溶液，共6份，再按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以5号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.00%（n＝6），相对峰面积的RSD均小于5.00%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.1.6 稳定性试验 精密称取KSC内容物（编号S4），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以5号峰为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.00%（n＝6），相对峰面积的RSD均小于5.00%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

2.1.7 指纹图谱建立、相似度评价及共有峰指认 取20批KSC内容物，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将各样品色谱图以“AIA”格式文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》进行分析。以S1为参照图谱，设置时间窗宽度为0.1 min，对色谱峰进行多点校正，随后进行Mark峰匹配，生成20批KSC的叠加指纹图谱，并采用中位数法生成对照指纹图谱（R），见图1。20批KSC样品图谱与对照指纹图谱（R）的相似度分别为1.000、0.997、0.999、0.999、0.999、1.000、0.999、1.000、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000、0.998、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000，均大于0.99，说明各批次样品的质量较稳定、一致。共标记了12个共有峰；通过对比KSC供试品溶液（编号S4）和混合对照品溶液的色谱图，共指认出6个色谱峰，分别为去甲异波尔定（1号峰）、盐酸益母草碱（3号峰）、连翘酯苷B（5号峰）、毛蕊花糖苷（6号峰）、金石蚕苷（7号峰）、异毛蕊花糖苷（9号峰），结果见图2。

图1 20批KSC样品的UPLC叠加指纹图谱及对照指纹图谱（R）

图2 KSC供试品溶液和混合对照品溶液的UPLC叠加图

2.2 含量测定

2.2.1 专属性试验 取“2.1.1”项下混合对照品溶液、“2.1.2”项下供试品溶液和空白对照溶液（50%甲醇），按“2.1.3”项下色谱条件下进样测定，记录色谱图（图略）。结果显示，空白对照溶液对6种成分的检测无干扰，提示方法专属性良好。

2.2.2 线性关系考察 按“2.1.1”项下方法制备混合对照品溶液，用50%甲醇作溶剂，配制成系列浓度梯度的对照品混合溶液：去甲异波尔定质量浓度分别为1.625、3.250、6.500、13.000、26.000、52.000 μg/mL，盐酸益母草碱质量浓度分别为2.734、5.469、10.938、21.875、43.750、87.500 μg/mL，连翘酯苷B质量浓度分别为4.688、9.375、18.750、37.500、75.000、150.000 μg/mL，毛蕊花糖苷质量浓度分别为4.563、9.125、18.250、36.500、73.000、146.000 μg/mL，金石蚕苷质量浓度分别为 5.250、10.500、21.000、42.000、84.000、168.000 μg/mL，异毛蕊花糖苷质量浓度分别为5.469、10.938、21.875、43.750、87.500、175.000 μg/mL。取上述系列对照品混合溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各成分的质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表1。结果表明，6种成分在其相应质量浓度范围内与峰面积的线性关系良好。

表1 KSC中6种成分的回归方程与线性范围

2.2.3 精密度试验 精密称取KSC内容物（编号S1），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.3”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，6种成分峰面积的RSD均小于3.00%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.2.4 重复性试验 精密称取KSC内容物（编号S1），共6份，按“2.1.2”项下方法平行制备供试品溶液，再按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并用外标法计算6种成分的含量。结果显示，6种成分含量的RSD均小于3.00%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.2.5 稳定性试验 精密称取KSC内容物（编号S1），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、6、12、24 h时按“2.1.3”项下色谱条件测定，记录峰面积。结果显示，6种成分峰面积的RSD均小于3.00%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

2.2.6 加样回收率试验 精密称取已知含量的KSC内容物（编号S1）6份，每份约0.5 g，分别按与已知成分含量1∶1的比例加入混合对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果显示，去甲异波尔定、盐酸益母草碱、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蚕苷、异毛蕊花糖苷的平均加样回收率分别为94.53%、100.55%、99.92%、102.98%、97.85%、101.16%，RSD均小于3.00%（n＝6），表明方法准确度良好。

2.2.7 样品测定 取20批KSC内容物，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。每批样品平行测定3次，根据外标法计算样品中各成分的含量，取平均值。结果见表2。

表2 20批KSC样品中6个成分的含量（n＝3，mg/g）

2.3 网络药理学研究

通过分析20批KSC的指纹图谱及含量测定结果，推测金石蚕苷、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、去甲异波尔定、盐酸益母草碱可能为KSC的Q-marker，遂采用网络药理学方法进行进一步的分析。

2.3.1 活性成分靶点及宫颈炎相关靶点筛选 将金石蚕苷（poliumoside）、连翘酯苷B（forsythoside B）、毛蕊花糖苷（acteoside）、异毛蕊花糖苷（isoacteoside）、去甲异波尔定（norisoboldine）、盐酸益母草碱（leonurine hydrochloride）作为关键词输入TCMSP数据库与分析平台（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），共获取到这6个成分的126个靶点，通过UniProt数据库（http：//www.uniprot.org/）将靶点名转换为对应的基因名。通过PubChem数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）进行检索，将所得成分分子结构文件导入SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）进行靶点预测。检 索 GeneCards（http：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）数据库获取与宫颈炎相关的靶点。将GeneCard、OMIM数据库检索到的宫颈炎的靶点结果合并，去除重复数据，获得宫颈炎相关疾病靶点1 447个。对药物靶点与疾病靶点取交集，得到KSC治疗宫颈炎的作用靶点52个，将结果导入Cytoscape 3.7.2软件，获得“药物-成分-靶点”网络（图3）。

图3 KSC治疗宫颈炎的“药物-成分-靶点”网络

2.3.2 蛋白-蛋白互作网络 将KSC治疗宫颈炎的52个潜在靶点导入STRING在线数据库（https：//string-db.org/），限定物种为“Homo sapiens”，设置最低置信度为0.9，同时隐藏游离的靶点，将所得靶点的相互作用信息导入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化分析，构建蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络。利用“Analyze Network”功能对PPI网络进行拓扑学分析，计算各节点的度值（degree）、介数中心性（betweenness centrality，BC）和接近中心性（closeness centrality，CC），以degree、BC、CC的中位数为阈值筛选得到14个核心靶点（图4），即为KSC治疗宫颈炎的关键靶点。按照degree对关键靶点进行排序，将排名前2位的靶点即蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）作为核心靶点进行分析。

图4 KSC治疗宫颈炎关键靶点的PPI网络图

2.3.3 基因本体和KEGG通路富集分析 将潜在核心靶点导入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。KEGG通路富集分析显示，潜在靶点参与了94条通路，主要包括炎症反应、免疫调节、激素调节、氧化应激、癌症通路及细胞生长、增殖、凋亡等，其中磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3K）-AKT通路是最重要的一条通路。GO富集分析共涉及230条信息，其中生物学过程184条，主要涉及炎症反应、信号转导、药物反应；细胞组分25条，主要与胞液、细胞核等有关；分子功能21条，主要包括调控蛋白激酶、PI3K活性等。

2.4 分子对接

从“成分-核心靶点”网络中将基因靶点以degree值的高低进行排序，选取前2个关键靶点（AKT1、TNF）分别与6个成分进行分子对接。从RCSB蛋白数据库（https：//rcsb.org/）中获得靶点（TNF、AKT1）的三维结构文件，通过AutoDockTools软件对蛋白晶体结构进行初始化处理，并转换为对接所需“pdbqt”格式文件。通过Chem3D Pro 14.0软件对化学成分的三维结构进行MM2力场优化，并通过AutoDockTools软件设置可旋转键数并转换为对接所需“pdbqt”格式文件。采用AutoDock Vina分子对接软件进行分子对接打分。较低的自由结合能更有利于受体和配体之间的结合[13]。6个成分与靶点的最低结合能均小于0，其中6个成分与AKT1的结合能均小于－6.6 kJ/mol，与TNF的结合能均小于－6.4 kJ/mol，提示分子间具有很好的结合亲和力。KSC的主要活性成分和核心靶点的高结合能力表明KSC可能是通过调节以上靶点发挥治疗作用的。

3 讨论

中药质量控制是保证中药临床用药安全和有效的重要措施[14]。目前，仅见廖春玲[15]对抗宫炎制剂（片剂、颗粒剂、胶囊）展开过HPLC指纹图谱研究。本研究建立了KSC的UPLC指纹图谱，同时对其中的6个成分进行了含量测定，并通过网络药理学和分子对接研究分析出去甲异波尔定、盐酸益母草碱、连翘酯苷B、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷可作为KSC的Q-marker。

KSC清湿热、止带下的功效与其主要活性成分的抗菌、抗炎等作用密切相关。据文献报道，广东紫珠为KSC方中君药，主要活性成分为苯乙醇苷类，包括金石蚕苷、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷；益母草的主要活性成分为益母草碱；乌药的活性成分为去甲异波尔定。从KEGG通路富集结果来看，PI3K-AKT通路是最重要的一条通路，该通路已被证明是免疫反应调节的关键通路[16]。PI3K-AKT通路可通过激活AKT下游的核转录因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、雷帕霉素靶蛋白、缺氧诱导因子1来促进促炎细胞因子的产生，从而诱发炎症反应[17]。盐酸益母草碱可通过NF-κB信号通路抑制炎症反应并改善骨关节炎大鼠的软骨退化，同时对酒精性肝损伤也有保护作用[18]；连翘酯苷B可通过抑制NF-κB信号通路减轻阿尔茨海默病的神经炎症[19]；毛蕊花糖苷具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗病原微生物、保护神经等多种药理作用[20]，其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路从而抑制TNF-α、IL-6的释放有关[21]；金石蚕苷具有抗炎、抗氧化、保护神经等作用，可通过抑制NF-κB信号通路减轻TNF-α诱导的细胞损伤[22]；去甲异波尔定具有抗炎、调节脂代谢、治疗急性肺损伤等作用，可通过下调丝裂原激活蛋白激酶来抑制脂多糖刺激的RAW264.7细胞中促炎细胞因子的产生[23]。由此可见，KSC可能通过相关靶点调节PI3K-AKT通路及其下游靶点通路来抑制炎症因子的释放，从而起到抗炎作用。

综上，去甲异波尔定、盐酸益母草碱、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蚕苷、异毛蕊花糖苷可作为KSC的Q-marker。