菜籽肽的酶法制备、分离纯化及生物功能特性研究进展

翟晓娜，裴海生，梁 亮，张志民，胡雪芳，李旭锐，孙 昊

农业农村部规划设计研究院 农业农村部农产品产后处理重点实验室, 北京 100125

生物活性肽是蛋白质水解过程中产生的一类对生物体生命活动具有特殊调节功能的低分子聚合物，通常由2～20个氨基酸以不同组成和排列方式构成，表现为二肽到复杂的线形、环形等不同结构。已有研究表明，生物活性肽具有潜在的抗氧化[1]、抗炎症[2]、降血压[3]、抑菌[4]及免疫调节[5]等功效，在健康食品及膳食补充剂等方面应用潜力巨大。

油菜籽是继大豆和棕榈之后的世界第三大植物油原料，其榨油后的饼粕占60%～65%。菜籽粕中蛋白质含量高达30%～45%，且氨基酸组成合理，含有丰富的含硫氨基酸及一定量的赖氨酸，如Met、Arg、Lys含量分别约为2.3%、4.1%、6.7%[6]。我国作为菜籽饼粕消费大国，2019—2020年消费总量可达0.11亿t，但一直用于饲料领域，产业附加值较低，高附加值利用菜籽饼粕已成为人们关注的焦点。目前，已有研究表明以菜籽饼粕为原料经水解或微生物发酵制备的菜籽肽或蛋白水解物一定程度上具有抗氧化[7]、降血压[8]、抗肿瘤[9]、促睡眠[10]及螯合金属离子[11]等多种功效，且菜籽低聚肽不致敏。同时，随着科学技术的进步及仪器设备的更迭换代，如电渗析超滤膜技术[12]、超声波辅助[13]、高静压技术[14]等的出现推动了活性肽在分离纯化和结构鉴定方面的发展，为进一步明晰菜籽活性肽的作用机制、促进其产业化应用提供了有力支撑。

1 菜籽肽的制备与分离纯化

通常先采用酶解法、化学水解或微生物发酵法处理蛋白原料得到肽类化合物与游离氨基酸的混合物，再依据分子量、疏水性、带电量等不同特征采用超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析等手段获得目标肽。其中，酶解法具有生产条件温和、选择性高、有机溶剂残留少、对蛋白质营养破坏小等优点，是菜籽肽目前最主要的制备方法，但成本高、产量低、食品级酶可选择性低，一定程度上又限制了其工业化生产[15]；化学水解法虽成本低，但生产缺乏选择性且会影响肽的生物活性[16]；而微生物发酵法因其可有效提高饼粕粗蛋白的消化率、降低硫苷等抗营养因子含量，多用于饲料行业[17]。本文主要对菜籽肽的酶法制备进行讨论。

1.1 酶法制备

蛋白酶因具有专一的酶切位点而成为酶法制备目标活性肽的关键，目前常用于制备菜籽肽的酶多为嗜热菌蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、枯草菌素等微生物源蛋白酶，以及部分木瓜蛋白酶等植物源蛋白酶。如王凤章等[18]以菜籽分离蛋白为原料，采用嗜热菌蛋白酶水解结合超滤分离得到了4种不同分子量菜籽肽，其中分子质量低于3 kDa的肽段占比达60%以上，并均含有较高比例的疏水性氨基酸。Zinchenko等[19]用枯草菌素G3x酶处理菜籽饼粕20 h后得到的水解物分子质量集中分布在1.5～16 kDa，游离氨基酸为8%。Pan等[20]用Alcalase 2.4 L FG水解菜籽蛋白至25%时得到的肽段其分子质量90%以上均<1 kDa，且富含Glu、Pro、Gly、Arg、Phe等。Alashi等[21]对比分析了5种商业酶(碱性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰酶)酶解菜籽饼粕水解物，发现均含约40%的疏水性氨基酸，且缺乏Cys；进一步利用截留分子质量为1、3、5、10 kDa的超滤膜分离水解物，发现碱性蛋白酶有利于制备分子质量较小的蛋白水解物(分子质量<1 kDa肽的得率为30.06%±0.47%)，而其他4种酶解肽段分子质量大多分布在1～3 kDa。除单一酶解法外，姚轶俊等[9]采用碱性蛋白酶-风味蛋白酶复合酶法，制备得到的菜籽蛋白水解物其分子质量<3 kDa和<1 kDa肽段含量分别占比达71.58%和51.8%。另外，辅助利用Na2SO3可断裂蛋白质分子间和分子内二硫键的特性，可不同程度地提高酶解速率[22]。

随着研究的深入，超声、微波等辅助技术也逐步用于活性肽的制备中，但研究相对较少。李菊芳等[23]等发现微波辅助技术可大大提高菜籽饼粕的酶解效率，且获得的菜籽肽具有良好的溶解性、持水性和持油性。Wali等[24]辅助采用多频超声前处理得到的菜籽蛋白其结构松散、表面多微孔，且无规则扭曲及α-螺旋含量降低、β-折叠含量增加，推测超声波处理可通过改变菜籽蛋白微结构增加蛋白的酶切位点进而提高菜籽蛋白的水解速率。参考大豆蛋白肽、胡麻子肽等的制备方法，可进一步尝试开展高静压技术、亚临界水提取技术及脉冲电场处理技术在菜籽活性肽提取制备中的应用[25]。

菜籽肽酶解辅助提取技术应用见表1。

表1 菜籽肽酶解辅助提取技术应用

1.2 分离纯化

肽的分离纯化是其生物活性、结构鉴定及活性机制研究的基础。就菜籽肽的制备而言，通常会先利用植酸酶或酸前处理菜籽饼粕、乙醇处理菜籽蛋白去除其中植酸、酚类物质及硫苷等抗营养物质[27-28]，再根据肽的分子量、电荷性质及疏水性等理化性质的不同选择分离纯化方法，目前主要选用膜分离、凝胶过滤色谱(size exclusion chromatography，SEC)及反相高效液相色谱法(reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)等。膜分离技术主要根据酶解组分中物质的分子量分布进行大量混合物的初步分离富集，具备条件温和可控、可连续化处理的优点，但容易出现膜堵塞的问题，He等[12]针对高通量超滤膜易堵塞污染的问题，引入电渗析-超滤耦合技术(cutoff=20 kDa)实现了靶向分离菜籽ACE抑制肽，且该方法可实现大规模活性肽的分离纯化。SEC则依据填充胶对被分离混合物因分子大小不同而阻滞作用不同进行分离，具有分离速度快、效果好、产物不易变性等特点，通常使用Superdex G-系列填充胶；RP-HPLC是依据肽疏水性的差异进行分离纯化的一种方法，具有选择性较高的优点，通常用于分离纯化分子质量<5 kDa肽段，尤其是极性小分子肽[7]，但设备昂贵，且存在着对亲水性小分子肽保留率低的缺点。实际研究中，单一分离方法往往无法满足获得高纯度、高活性肽的要求，菜籽活性肽目前主要采用超滤-凝胶过滤色谱-离子交换色谱/反相-高效液相色谱等组合技术进行分离纯化，如利用固相萃取(SPE-Sep-Pak C18)浓缩预分离-超滤(cutoff=3 kDa)-RP-HPLC(C18)分离纯化ACE抑制肽[29]；综合采用超滤(cutoff=10 kDa)、Sephacryl S-100HR凝胶层析及RP-HPLC(C18)技术，分离纯化抗氧化肽(Trp-Ile(Leu)-Tyr)等[7]。此外，去除蛋白水解过程中产生的苦味物质及额外添加的盐也是其纯化的重要步骤之一，目前研究已确认山柰酚 3-O-(2″-O-芥子酰-β-槐糖苷)(阈值为3.4 μmol/L)是引起菜籽蛋白水解产物苦味的关键物质，该物质主要在菜籽饼粕生产过程中产生[30]，可通过阿魏酸酯酶处理降解其含量的65%[31]，但工业化处理仍需进一步研究优化。就生产过程中添加的盐类物质，一般可通过纳滤(nanofiltraton, NF)、大孔树脂吸附等技术等进行精制处理[32]。

菜籽肽的分离纯化技术见表2。

2 菜籽肽的生物活性

菜籽肽的活性与其氨基酸种类、数量及排列顺序有关，如碱性氨基酸和酸性氨基酸具有较强的螯合金属离子能力，疏水性氨基酸含量的增加可显著增强肽与不饱和脂肪酸的反应。研究表明，菜籽肽与菜籽蛋白相比吸收效率较高，且具有一定的生物活性，如降血压、抗氧化、螯合金属离子、促睡眠等，在医药、食品等领域具有广阔前景。

2.1 ACE抑制活性

高血压作为一种全球性的公共健康问题，是中风、心力衰竭等许多疾病的诱因。ACE 可通过肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统发挥作用而导致血压升高，抑制ACE是抗高血压的首要策略[35]，利用食源性ACE肽进行降压干预是研究热点之一。从菜籽饼粕或菜籽蛋白中分离提取ACE抑制肽也逐步受到关注。Marczak等[8]以自发性高血压大鼠为模型首次对菜籽酶解肽的降血压活性进行评价，发现枯草杆菌蛋白酶酶解菜籽饼粕产生的IY、RIY、VW、VWIS肽段均具有一定的降血压活性，并呈浓度依赖效应，且RIY及VWIS为首次发现的ACE抑制肽；其中RIY主要通过前列腺素 PGI2-IP受体及胆囊收缩素CCK-CCK1受体途径耦合上调血管舒张，降低外周血管阻力抑制血压升高[36]。Wu等[37]从脱脂菜籽粕中首次鉴定出具有ACE抑制作用的食源性肽VSV，并发现该肽段主要存在于菜籽白蛋白中。He等[34,38-40]对菜籽蛋白源ACE抑制肽开展了系列研究，发现嗜热菌蛋白酶、蛋白酶K及碱性蛋白酶水解物均具有较高的ACE抑制活性，并以碱性蛋白酶水解物效果最优，其中膜分离分子质量<1 kDa组分的ACE抑制活性最大(水解度11%，抑制率约84%)，并利用SEC、RP-HPLC等方法分离鉴定出LY、TF、GSH、RALP等ACE活性二肽、三肽，其中二肽LY的ACE抑制能力最强(IC50=0.11 mmol/L)且可被Caco-2细胞模型完整吸收，即肽的ACE抑制活性不仅与其分子量相关，并与其疏水性氨基酸含量呈正相关；值得注意的是，菜籽蛋白初始水解物与其各膜分离组分相比其肾素抑制活性偏低，这与Mäkinen等[29]发现的菜籽蛋白水解物、SPE分离蛋白、超滤组分ACE抑制IC50逐渐增大的研究结果一致，推测菜籽蛋白水解物中各活性肽可能具有协同作用；且有研究表明超声前处理可有效提高酶解菜籽肽组分的ACE抑制活性[24]。

综合而言，菜籽蛋白源水解物具有一定的ACE抑制活性，且大部分ACE抑制肽为氨基酸数量为2～4的短肽，其活性受疏水性氨基酸含量的影响，这可能与疏水性氨基酸可通过与ACE活性位点的氨基酸残基形成氢键而引起ACE几何结构畸变失活有关。此外，目前关于菜籽蛋白源ACE抑制肽研究仍多集中于活性肽的分离筛选，对活性肽的加工稳定性、消化环境稳定性及活性协同/拮抗作用需进一步加强。

菜籽蛋白源ACE抑制肽见表3。

表3 菜籽蛋白源ACE抑制肽

2.2 抗氧化活性

氧化应激通常与许多慢性疾病如动脉粥样硬化、心血管疾病等息息相关，通过摄入外源抗氧化补充剂增强机体抗氧化能力已成为趋势。菜籽蛋白源水解物/肽已被证明具有良好体外自由基清除能力及细胞氧化应激模型保护作用，通常含2～15个氨基酸残基，且活性与其一级结构紧密相关(表4)。薛照辉等[41]发现经碱性蛋白酶和复合风味酶分步酶解得到的菜籽肽通过腹腔注射可有效抑制小鼠血清中丙二醛(malondialdehyde, MDA)的生成，并呈现浓度依赖效应。张瑞等[42]利用Sephadex G-15从固态发酵菜籽饼粕中分离到的两个肽段(171 Da、794 Da)均表现出良好的体外自由基清除能力，且小分子量肽段在各浓度下均表现较优，推测肽段的分子量可直接影响其抗氧化活性。Wang等[7]发现采用碱性蛋白酶酶解法获得的高抗氧化活性菜籽蛋白水解组分中含有较高的Glu、Gly、Ala、Tyr、Pro，并进一步分离纯化出抗氧化肽WI(L)Y；结合章绍兵等[43]分离出的RNL(I)PY、YPL(I)YE抗氧化肽，发现菜籽抗氧化肽的C-端或N-端均为Tyr(Y)残基，且通常当Tyr位于肽链N-端时其抗氧化活性较强[44]。进一步地，Xu等[45]利用H2O2处理HUVECs细胞模型探究了菜籽抗氧化肽WDHHAPQLR(1 158.619 5 Da)的活性机制及吸收代谢，发现该肽段主要通过细胞旁路被小肠上皮细胞吸收(渗透系数(0.82±0.19)×10-6cm/s)，并被降解为DHHAPQLR、WDHHAP、QLR 3个主要组分，可通过上调Bcl-2的表达而抑制HUVECs细胞凋亡发挥其生物活性；相比较，YWDHNNPQIR(1 341.539 8 Da)这一抗氧化肽段在Caco-2 细胞模型中的表观吸收率相对较低(渗透系数(0.66±0.12)×10-6cm/s)，被上皮细胞吸收后主要被降解为WDHNNPQIR、DHNNPQIR、YWDHNNPQ[46]，且研究表明静脉注射该抗氧化肽可通过抑制丝裂原激活蛋白激酶调节MAPK与NF-κB路径缓解糖尿病肾病小鼠模型的肾纤维化[47]。此外，不同种类酶的酶解产物其抗氧化活性也不尽相同，如“胃蛋白酶+胰酶”菜籽蛋白酶解产物与碱性蛋白酶、风味蛋白酶、嗜热菌蛋白酶等酶解产物相比具有较强的DPPH自由基清除能力，但其抑制亚油酸氧化能力较弱；而风味蛋白酶酶解物和碱性蛋白酶酶解则分别具有较强的Fe2+螯合能力与超氧阴离子清除能力[48]，这可能主要与酶的专一性造成不同酶解产物中各肽段的氨基酸残基不同有关。

表4 菜籽蛋白源抗氧化肽

综合而言，菜籽蛋白源活性肽具有良好的体内外抗氧化活性，其抗氧化能力与制备方法、分子量大小、氨基酸组成息息相关。有研究发现抗氧化肽WDHHAPQLR的稳定性不受食品加工中苯甲酸钠等添加剂的影响，但在强酸、强碱及高温环境下极易失活[49]。后续应进一步加强抗氧化肽的应用稳定性及加工适宜性研究，推进其市场化应用。

2.3 其他生物活性

目前除对菜籽源ACE抑制肽和抗氧化活性肽研究较多外，还发现菜籽肽具有螯合金属离子、抗肿瘤、改善睡眠、抑菌、抗炎等生理活性(表5)。

表5 其他菜籽活性肽

金属离子螯合肽是一类通过配位键与金属离子发生螯合反应而生成具有环状结构的螯合物，可被用作抑菌剂、食品添加剂、动物饲料及金属离子补充剂等，商业价值潜力和研究前景较好。Xie等[11]通过碱性蛋白酶酶解菜籽蛋白、Sephadex G-25层析分离得到了AR、NSM、GKR、GPSH等4个肽段，其中NSM具有最强的锌离子螯合能力，电感耦合等离子体质谱仪(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)测定其锌离子螯合能力可达82.12%，远高于GSH 62.45%的螯合能力，并推测菜籽肽螯合能力主要与其N-端 Asn残基有关。此外，菜籽蛋白酶解物/肽也被证明具有一定的抗肿瘤活性，可抑制S180[50]、HepG2人肝癌细胞[51]及MCF-7细胞[52]的体外增殖，Wang等[53]通过RP-HPLC及电喷雾电离串联质谱(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS/MS)等得到的菜籽低聚肽WYP(408.2 Da)能够显著改变HepG2的形态学特征、抑制细胞增殖。Yust等[54]发现菜籽蛋白的碱性蛋白酶水解物能够有效抑制HIV蛋白酶，为HIV蛋白酶抑制的研究提供了新的路径。王禹程等[10]发现菜籽多肽粗提物可延长小鼠睡眠时间；He等[55]发现化学合成制备的菜籽源蛋白肽LY、RALP、GHS 可通过抑制RAW264.7巨噬细胞中iNOS酶的表达而降低NO的分泌、降低细胞炎症因子IL-6、TNF-α的含量，从而发挥抗炎活性。总体来说，菜籽蛋白酶解物/肽具有良好的生物活性。

3 展望

国内目前对菜籽饼粕的规模化利用包括制取浓缩饲用蛋白和菜籽肽，前者由于原料价格上涨和终端市场疲软而受到限制，菜籽肽已被证明可直接或通过体内外酶解对人体的生理及代谢产生积极影响，同时菜籽蛋白水解物也可应用到糖果、糕点、蛋黄酱等搅打食品中，在改善产品感官品质的同时提高其营养功能，菜籽肽市场前景广阔。但现在市场上菜籽肽类产品仍寥寥无几，且多为多种分子量肽的混合物，产品功效同质性严重，活性肽生产过程中苦味氨基酸的产生及酶解成本高也是制约菜籽肽市场化的重要原因。菜籽肽生物活性的构效关系及其环境稳定性、应用稳定性的明晰对于其市场化也是非常重要的。

在后续研究中，一是应注重活性肽的制备过程研究，已知蛋白的水解程度与其活性、物化特性紧密相关，掌握肽制备的动力学特征及其与产物物化特性的关系，有助于提高目标肽的生产效率及感官品质；可利用电脑模拟菜籽蛋白酶解方法，通过对酶解肽段进行构效分析，构建目标活性肽仿真分析，为菜籽肽的活性挖掘及制备提供理论基础及超级算力。二是强化活性肽特征研究，包括活性肽的体内外稳定性及加工稳定性，系统研究环境因素如温度、pH值、离子强度、口腔及肠胃道，食品加工工艺如热处理、超高压、挤压处理以及应用微环境组分如酚类、多糖及脂类物质对肽稳定性的影响，明晰活性肽的储运特征及其使用范围；同时还需对活性肽的可接受度开展研究，其中针对肽代谢稳定较差及适口性弱的问题，尝试采用分子接枝技术及稳态化技术提高其稳定性、拓宽其应用场景。三是阐明活性肽的活性机制，尤其是酶解产物中不同肽之间生物活性的协同拮抗作用，利用分子对接探究配体与受体之间的相互作用，通过揭示两者的结合位点与结合模式，解析活性肽的关键基团及其作用机制，在此基础上进一步开展肽改性研究及结构设计，为充分高效利用菜籽肽提供基础，使其在食品营养健康领域具有更广阔的发展前景。