两种方法检测结核分枝杆菌的价值分析

曾庆雪，周 明，唐柳生

广西壮族自治区胸科医院检验科，广西柳州 545005

结核病是由结核分枝杆菌复合群引起的慢性传染病，是我国的乙类传染病，以炎性渗出、增生和干酪样坏死为主要病理表现。世界卫生组织发布的报告指出，结核病是世界上最重要的传染性疾病之一[1]。结核病主要影响肺部，但也会影响身体的其他部位，需及早诊断和治疗，大多数可以预防。有关流行病学调查结果表明，我国约有93万人感染了结核分枝杆菌[2]，特别是肺结核排菌患者将菌排出体外，通过空气传播，以致他人感染。目前检测结核分枝杆菌最经济的方法还是传统涂片法，现就痰标本涂片用荧光显微镜人工阅片(简称人工阅片)和自动扫描仪检测结果进行比较。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集本院疑似为结核病患者的133例合格痰标本(脓痰47例，血痰9例，黏液痰77例)，同时进行抗酸杆菌涂片和结核分枝杆菌培养。

1.2仪器与试剂 宁波舜宇仪器有限公司生产的结核分枝杆菌FS400显微镜扫描系统(简称FS400)、宁波舜宇仪器有限公司生产EX30/DMEX30生物荧光显微镜。珠海贝索金胺O染色液、珠海贝索中性罗氏培养基、珠海贝索抗酸染色液(萋尼氏法)、N-乙酰-L半胱氨酸-氢氧化钠(NALC-NaOH)混合溶液(等体积6%的NaOH溶液和2.9%的柠檬酸钠溶液混合，每100 mL混合溶液加入0.5 g NALC粉末溶解)，pH值为6.8的磷酸盐缓冲液。

1.3方法

1.3.1结核分枝杆菌涂片 用经高压灭菌的竹签挑取可疑部分痰液进行涂片，自然干燥后金胺O荧光染色：(1)标本滴加金胺O染液染色15 min，水洗。(2)3%盐酸乙醇溶液脱色1～2 min或至无色，水洗。(3)加复染剂(0.5%高锰酸钾溶液)复染2～4 min，水洗。(4)干燥后在暗室镜检：首先以10×目镜、20×物镜进行镜检，发现疑为抗酸杆菌，使用40×物镜确认。

1.3.2FS400阅片与人工阅片 经金胺O荧光染色好的133份痰标本涂片用EX30/DMEX30生物荧光显微镜进行人工阅片，做好记录，人工阅片完毕后再放至FS400阅片，结果出来后，把两种方法阅片结果登记并进行比较。

1.3.3结核分枝杆菌的罗氏固体培养观察过程 在生物安全柜内将2～5 mL痰标本放入离心管；向离心管内加1～2倍体积的NALC-NaOH混合溶液，涡旋振震荡后消化15 min直至充分液化；向离心管中加入磷酸盐缓冲液至45 mL，拧紧盖子，低温离心机(8～10 ℃)，3 000×g，离心15 min；取出离心管，小心弃去上清液，加入1 mL磷酸盐缓冲液，混匀；把中性罗氏培养基多余的凝固水弃去，每份标本接种两只培养基，每支培养基接种0.10～0.15 mL(2～3滴)，布满培养基表面。统计所有结果，对培养长菌标本进行涂片，采用萋尼染色确认培养阳性的结果。

1.3.4菌株涂片进行萋尼染色 (1)菌膜自然干燥后固定，滴加石炭酸复红染液盖满玻片，加热至出现蒸汽后，停止加热，染色 5 min，染色期间始终保持菌膜被染液覆盖，水洗沥干。(2)滴加5%盐酸乙醇溶液脱色1～2 min或至无可视红色染液为止，水洗沥干。(3)滴加亚甲蓝复染30～60 s，冲去染液，干燥后镜检。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0对数据进行分析。计数资料以百分数表示，组间比较采用χ2检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1133例痰标本采用 FS400和人工阅片检测的阳性率比较 133例痰标本 FS400扫描出阳性53例，阳性率为39.8%(53/133)，人工阅片检出阳性34例，阳性率为25.6% (34/133)，两者比较差异有统计学意义(χ2=6.080，P=0.014)。

2.2FS400和人工阅片检测结果对比 两种方法阅片，结果的一致率为84.2%(112/133)，见表1。

表1 FS400和人工阅片检测结果比较(n)

2.3两种方法检测结果不一致者与罗氏固体培养结果的分析 FS400扫描阳性而人工阅片阴性的结果中，罗氏固体培养结果阳性5例；FS400扫描阴性而人工阅片阳性1例，且罗氏固体培养结果为阳性。

2.4罗氏固体培养与FS400、人工阅片结果的比较 以罗氏固体培养结果为金标准，FS400检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异度分别为88.4%(38/43)和83.3%(75/90)，阳性预测值和阴性预测值分别为71.7%(38/53)和93.8%(75/80)；人工阅片检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异度分别为79.1%(34/43)和100.0%(90/90)，阳性预测值和阴性预测值分别为100.0%(34/34)和 90.9%(90/99)。

3 讨 论

结核分枝杆菌的检测工具有很多，但使用最广泛的是痰涂片镜检，在低收入和中等收入国家，使用传统光学显微镜进行痰涂片镜检是诊断肺结核的主要方法[3]，为保证显微镜检查的质量，结核病实验室检验规程规定：每天一名镜检人员的涂片阅读量不应超过25张[4]，阅片量远远满足不了临床的需求与日益增加的标本量。人们已经尝试采用从显微镜下的痰涂片图像中识别结核杆菌[5]，自动阅片扫描仪的使用对我国控制和及时治疗结核病提供了很大的帮助。快速检测结核病对我国控制及治疗结核病至关重要。结核病病原体结核分枝杆菌的检测技术的不断改革：从萋尼染色到金胺O染色法，提高了阳性率和特异度[6]。本研究结果显示，FS400阅片阳性率(39.8%)高于人工阅片阳性率，李强等[7]研究结果显示，扫描仪阳性率(32.1%)略高于传统荧光显微镜检查(31.9%)，检测效能较高，在工作量大的实验室、特别是人员缺乏的实验室，扫描检测技术可以作为传统检查的替代工具。金胺O荧光染色法是一种高效率的检查方法，但容易受到其他荧光染色物质干扰，FS400荧光染色的不足为将非抗酸杆菌也判读阳性，本研究中FS400实际条数阳性总数为16份标本，人工阅片有14份阴性，占比87.5%(14/16)。抗酸杆菌分离培养是结核病诊断的金标准，因此，抗酸杆菌的培养对结核病早期发现和早期治疗控制起到非常重要作用[8]，且培养阳性率较涂片高。两种阅片方法阴阳性不一致者与培养阳性结果中FS400符合率[83.3%(5/6)]更高，抗酸涂片镜检对菌量要求高，灵敏度低，要求菌量达(5～10)×103/mL才能检出，因此涂片镜检阳性检出率仅30% 左右[9]，FS400灵敏度和阴性预测值较人工阅片高，基于以上统计数据，FS400可以作为筛查工具。

影响扫描仪结果的因素为涂片质量，涂片过厚或过薄，FS400提示涂片阴性异常，无法判读结果。染色时间较短，荧光无法上色会出现判读阴性；染色时间过长，杂质也会染上荧光，仪器也会判读阳性。脱色时间要够，冲洗一定要干净，否则仪器会判读阳性。实验室操作人员应加强培训，保证涂片质量的可靠。临床留取标本是检验结果可靠的前提[10]，文献报道，高质量痰标本涂片检查的阳性率可达62%[11]，不合格痰标本(唾液)的阳性率仅为1%[12]。只有合格标本才能得到正确的检验结果。

金胺O荧光染色法在低倍镜下可观察菌体呈亮绿色，背景黑暗，具有清晰的形态特征，不容易出现漏检情况，使镜检效率显著提高,杂质在荧光显微镜蓝色激发后，可产生亮绿色荧光，与抗酸杆菌相似，容易与之混淆[13]，钟丽云[14]及樊晓东等[15]研究显示，金胺 O 荧光染色法不容易出现漏检情况，使镜检效率显著提高，可作为诊断结核病的有效手段。

在结核病诊断中使用FS400能够获得更高的灵敏度。人工阅片时如果在低倍镜下见形似抗酸杆菌，尤其是少量分布的形似抗酸杆菌，可调至高倍镜，或者由经验丰富的镜检人员确认。FS400阳性和异常结果必须经过人工阅片才更为可靠，FS400减轻了工作人员负担，提高了工作效率，但不能完全替代传统显微镜人工阅片。近年来，医院患者不断增多，结核实验室工作量大幅上升，实验室空间和工作人员数量日显紧张，尽管人工阅片更可靠，但人工阅片的速度较慢，王前等[16]研究也证明自动阅片技术诊断病原学阳性肺结核的灵敏度高于人工阅片，可用于患者抗酸杆菌的筛查。FS400说明书强调需要注意扫描仪结果不做最终临床诊断依据，用户根据实际扫描图像进行人工判读，从而确定被检标本的最终结果，以防止假阴性而出现漏检。本研究中FS400阴性而人工阅片阳性标本1例，说明FS400出现假阴性结果，因此，扫描检测技术需要做进一步改善以便更能满足临床需求。但FS400检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异度较高，自动化程度高，值得推广应用。