藏药诃子提取物有效成分的测定及其对大肠杆菌体外抑菌作用的研究

周贵凤

（四川民族学院，四川 康定 626001）

藏猪仔猪腹泻病是由致病性大肠杆菌引起藏猪仔猪的一种肠道疾病，是危害藏猪仔猪健康的主要常发性疾病之一，给藏区养殖户造成巨大经济损失。庆大霉素、磺胺等药物是治疗本病的常用药物，但随着其在养殖业中的广泛使用，越来越多的病原菌产生耐药性，甚至还引起耐药性发生转移；此外，化学药物的不规范使用，可能导致药物在仔猪体内蓄积，造成药物残留，影响畜产品安全，危害人类健康。因此，寻找一种对藏猪仔猪腹泻性大肠杆菌抑菌效果显著，且不易产生耐药的药物具有重要临床价值和实践意义。

藏药因其特殊的生长环境可能会促使其产生特殊的代谢产物，而这些产物有可能会成为新药研发的先导化合物，再加上藏药作用靶点多，不易产生耐药性，有望成为治疗动物细菌性疾病的新型药物。诃子是最常用的藏药，在藏药学经典著作《晶珠本草》里被称为“藏药之王”和“治疗诸病的上品”。但目前人们对诃子研究不够深入，还未见有藏药诃子对藏猪仔猪腹泻性疾病的相关报道。

本试验采用醇提水沉法、水提醇沉法制备藏药诃子提取物，分别通过索氏提取法和凯氏定氮法测定了诃子提取物中粗脂肪及粗蛋白含量，探究其提取物对藏猪仔猪腹泻性大肠杆菌抗菌作用的影响，为诃子的开发和利用提供参考。

1 试验材料

1.1 试验药品

诃子购买于甘孜藏族自治州藏医医院。

1.2 试验菌种

菌种来自于孜州畜科所藏猪保种场中藏猪仔猪腹泻粪便中分离、鉴定并保存于四川民族学院农学实验室中的大肠杆菌。

1.3 试验药品

蒸馏水、乙醇、硼酸、氢氧化钠、盐酸、甲基红、溴甲酚绿、各类培养基等。

1.4 主要试验仪器及器材

凯氏定氮仪（K1100F，山东海能科学仪器有限公司）；石墨消解仪（SH420，山东海能科学仪器有限公司）；粗脂肪测定仪（SZF-06B，上海华睿仪器有限公司）；洁超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、恒温振荡器、恒温培养箱、pH测试计、恒温干燥箱、分析天平、电热套、冷凝管、三颈烧瓶等。

2 试验方法

2.1 藏药诃子提取物制备

准确称取一定量诃子置于三颈烧瓶内，加入沸石与搅拌磁石，加入无水乙醇至没过药材且不超过烧瓶2/3处。将药液浸泡30min，78℃加热并冷凝回流1h。冷却、过滤，收集滤液。继续向药渣中加入乙醇，按上述方法再次回流煎煮药液。将两次滤液合并后浓缩，按1：3加入蒸馏水，置于4℃冰箱中水沉12h，再过滤，滤液浓缩、定容，使药浓度为1g/mL。灭菌后保存于冰箱冷藏备用。

除了将煎煮溶剂换为蒸馏水外，操作流程按上述醇提物的方式进行，将两次滤液合并浓缩后按1：3加入无水乙醇，置于4℃冰箱中醇沉12h后再过滤浓缩、定容，使生药浓度为1g/mL。灭菌后保存于冰箱冷藏备用。

2.2 测定藏药诃子提取物的pH值

配置邻苯二甲酸氢钾及硼砂标准缓冲液，用二点标定法对pH计进行标定后对进行样品进行pH值测定。

2.3 藏药诃子提取物中粗脂肪含量测定

采用索氏提取法测定诃子中粗脂肪含量。称量剪裁、编号后的滤纸重量，记为m；准确称量约1g的样品，精确到±0.001g，记为m1。用中速滤纸包好样品（其总重为M1=m1+m2），置于干燥无水棕色瓶，加无水乙醚至完全没过样品，密封棕色瓶至过夜（12h左右）。取80mL无水乙醚置于抽提瓶中，放入上述浸泡过夜的滤纸包，用脱脂棉压住试样，将抽提瓶连接冷凝管后置于55℃水浴锅中抽提300min。抽提结束后，回收乙醚，取出滤纸包，晾干后放入105℃恒温干燥箱中干燥至恒重后，称重为M2。粗脂肪重量m=M1-M2=m1+m2-M2，粗脂肪含量=m/m1*100%。

2.4 测定藏药诃子提取物中粗蛋白质含量测定

通过凯氏定氮法测定诃子中蛋白质的含量。按说明书提前配制好相关试剂，做好样品前处理，清洗管道通路，待数值稳定后，设置k=0，用空白消化管滴定测出较稳定的空白体积，取平均值（V）。在仪器上输入上述空白体积，设置k=1，用三只装有5mL硫酸铵的消化管进行滴定，测出滴定体积，根据空白体积、滴定体积、标准测试液计算出k值，并取平均值。每只消化管里加入待测样品（样品重量W），用标准酸进行滴定（V），测出蛋白质含量。N%=1.401*M（V-V）*k/W

注：M=标准酸摩尔浓度；W=样品重量（g）；V=空白样滴定标准酸消耗量（mL）；V=样品滴定标准酸消耗量（mL）；k=定标系数。

2.5 抑菌试验

将藏猪仔猪腹泻性大肠杆菌在肉汤培养基中复活，接种于麦康凯培养基中，挑取典型菌落接种于新鲜肉汤培养基中，37℃培养18h后，取0.1mL菌液，加入100mL灭菌营养肉汤培养基中稀释1000倍，备用。

用试管二倍稀释法测定藏药诃子提取物对上述大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）。取96支灭菌试管，将试管分为4大组，每个大组含3小组，1个小组有8支试管，各组内连续编号。每支试管中加入灭菌营养肉汤培养基2mL。

试验组：在每组第1管中加入2mL藏药，按二倍稀释法稀释至第6支试管，使前6支试管中的药物浓度依次为500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5 mg/mL、31.25mg/mL、15.63mg/mL，再向这6支试管中加入上述稀释的菌液0.1mL 。

对照组：将每组第7管设为阳性对照，即不加藏药提取物，只加等量菌液及肉汤培养基；将第8管为设阴性对照，即不加菌液，只加等量药液及肉汤培养基。

结果判定：将上述试管于37℃的恒温培养18h后，用接种环向各个试管中分别取一环混合液在伊红美蓝培养基上划线，恒温培养18h，观察试验结果。如果培养后试管澄清，说明细菌未生长，该浓度药液有抑菌作用；如果试管浑浊，则表示细菌生长，此浓度药液没有抑菌效果。以平板上不长细菌所对应的那支试管的最低药物浓度作为该药液提取物对该菌的MIC值。

3 试验结果

3.1 藏药诃子提取物的pH值

多数细菌的繁殖易受pH 值的影响。通过测定两种诃子提取物的pH值，其结果如表1所示：

表1 藏药诃子提取物的pH值

由表1可知，诃子两种提取物在常温下，其pH值均为弱酸性。

3.2 藏药诃子中粗脂肪含量测定结果

通过索氏提取法测定诃子的粗脂肪含量，其结果如表2所示：

表2 藏药诃子中粗脂肪的含量

由表2可知，诃子的粗脂肪含量为10.0189%。

3.3 藏药诃子提取物中粗蛋白质含量测定

通过凯氏定氮法测定诃子中蛋白质含量，其结果如表3所示：

表3 藏药诃子提取物中粗蛋白质含量

由表3可知，诃子醇提物中蛋白质含量为0.1128%，水提物中蛋白质含量为0.0450%。

3.4 藏药诃子提取物对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）

诃子提取物对大肠杆菌的最小抑菌浓度如表4所示。试验中阳性对照组中细菌生长良好，而阴性对照组未见细菌生长，说明该试验结果有效。

表4 藏药诃子提取物对大肠杆菌的抑菌作用

由表4可知，诃子醇提物对大肠杆菌的MIC为250mg/mL，而诃子水提物对大肠杆菌的MIC则大于500mg/mL，说明诃子醇提物对大肠杆菌的抑菌作用优于诃子水提物，对其有轻度抑菌作用。

4 分析与讨论

4.1 体外抑菌作用结果分析

本试验分别用水提法和醇提法制备了诃子提取物，并测定了其对藏猪仔猪腹泻性大肠杆菌体外抑制作用。结果表明，诃子醇提取物对大肠杆菌抑菌效果比水提物的抑菌效果强，可能的原因是水提法只能以水作为溶媒，选择性较差，只能提取某些无机盐、可溶性多糖、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐等物质。提取和灭菌过程中温度较高，可能会破坏热稳定性较差的物质，导致有效成分含量大大减少，从而降低其抑菌效果。乙醇的溶解性好，穿透能力强，不仅能提取水溶性物质，还提取某些脂溶性成分，如鞣质、酚酸、挥发油、帖类、蒽醌等成分。而诃子中鞣质类等具有抗菌作用的物质含量高达 23.6%～37.36%。由此可见，同种中药用不同方法制备的提取液对同一菌株会产生不同的抑菌作用。但其抑菌作用相较其对大肠杆菌质控菌弱，主要原因可能是该大肠杆菌已出现了一定程度的耐药性，故其抑菌作用总体来说不显著。

4.2 pH值测定结果分析

由表1可知，藏药诃子提取物的pH 值都偏酸性，其中，诃子醇提物的pH 值比水提物低，再根据表4结果推测，中药的pH值可能会对细菌的生长产生一定影响。但药物提取液的pH值对细菌抑制作用是否具有普遍性或对其影响力还需通过大量试验进行进一步研究。此外，该试验数据只源于体外抑菌作用的研究，而缺乏其在体内作用数据。由于中药进入机体体液、组织液和血液的浓度非常低，且机体中存在良好的天然缓冲体系，故药液对机体 pH 值往往影响较小。因此，后期研究体内药理作用临床试验确定中药的抑菌活性过程中，还需考虑其药物体内对机体pH变化对试验结果的影响。

4.3 粗脂肪提取结果分析

本课题组试验研究还发现诃子中粗脂肪含量（10.02%）比秦皮（8.17%）等药物的脂肪含量略高，而诃子的抑菌作用比秦皮的抑菌作用好，由此推测粗脂肪含量高的药物抑菌效果可能较好。这是由于粗脂肪中除脂肪外，还包括脂肪酸、磷脂、糖脂、脂溶性色素及维生素等物质。而作为阴离子的表面活性剂的脂肪酸具有一定抗真菌和维持脂肪代谢作用，通过其特有的化学结构和理化性质，能快速进入细菌细胞膜的脂质双分子层，破坏细胞膜结构，并渗透到细胞中并解离、释放出H，降低pH值，引起细菌细胞代谢障碍和衰竭，造成对酸性敏感的大肠杆菌则被抑制或杀死而起到抗菌的作用。

4.4 蛋白质测定结果分析

通过对诃子提取物中蛋白质含量进行测定，表3中显示诃子醇提物中蛋白质含量为0.1128%，水提物中蛋白质含量为0.0450%，即诃子醇提物中的蛋白质含量比水提物的蛋白质含量高，其抑菌作用也相对较高，由此可推测诃子中所含蛋白可能对大肠杆菌具有一定的抑制或杀灭作用，但后期还需通过进一步提纯试验进行验证。

5 结语

本试验研究了藏药诃子提取物对藏猪仔猪腹泻性大肠杆菌的体外抑菌效果。试验结果表明，诃子不同提取物对大肠杆菌的抑菌作用不相一致，其中，诃子醇提物对大肠杆菌有轻度敏感，而水提物对大肠杆菌不敏感。此外，还研究了诃子提取物的pH值、粗脂肪及粗蛋白质含量与抑菌作用之间的关系。结果发现两者提取物均为中性偏酸性，其中诃子醇提物pH值较低，抗菌作用稍强；而诃子中粗脂肪含量比秦皮等其他药物含量略高，诃子醇提物中的蛋白质含量比水提物的蛋白质含量高，其抑菌作用也相对较高。但由于试验对象偏少，样本量有限，要得出确切结论还需进一步研究。本试验研究了藏药诃子粗提取物的抑菌作用，今后可深入讨论药物中具体成分、含量以其体内药动学情况；此外，单味藏药在复方药的作用及其配伍禁忌也是今后研究的热点和方向。