四种市售花草茶抗氧化活性的评价

俞颖琦，张旭含，胡奕然，王寒怡，孙 苗，周 婷

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 311121)

花草茶是一种以花卉植物的根、茎、叶、花为材料，经过采收、干燥、加工后制成的冲泡式保健饮品.市场上常见的花草茶有茉莉花茶、玫瑰花茶、菊花茶、金银花茶、柠檬茶和百合花茶等[1].茉莉花茶是花草茶中产量最多的品种，具有安神、润肠通便、理气解郁等功效[1].玫瑰花茶是最受欢迎的花草茶之一，具有抗氧化、抗血栓、通经络、降血脂、助消化、美容养颜等作用[2-3].菊花茶是我国仅次于茶叶的第二大传统饮品，具有散风清热、平肝明目、药食两用等功效[4].菊花品类众多，本文重点选取贡菊为材料进行研究.金银花茶是近几年流行的保健花草茶饮品，具有疏散风热、清热解毒等作用[5-6].

长期以来，对以上4种花草茶的研究主要集中在工艺参数对品质的影响、加工过程中生化成分、香气组分的变化规律等化学、药理、临床方面[4,6-7].本研究主要检测某一厂家4种花草茶的总糖、总蛋白质、总游离氨基酸、茶多酚、总黄酮、儿茶素类化合物质量浓度，并分析它们与花草茶抗氧化活性的关联性，以期为花草茶的生物活性评价提供理论参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验样品为市场销售的同一品牌——忆江南(杭州忆江南茶业有限公司)的4种花草茶制品，分别为玫瑰花茶、茉莉花茶、金银花茶、贡菊花茶，样品均为干制的整花，无茶叶掺杂.4种花草茶的水分质量分数分别为：贡菊花茶(10.5±0.1)%>金银花茶(10.4±0.1)%>茉莉花茶(6.4±0.1)%>玫瑰花茶(6.2±0.6)%.

主要试剂：总糖检测试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司，Bio-Rad蛋白质测定染料浓缩物购于伯乐生命医学产品(上海)有限公司，牛血清蛋白标准品购于宝日医生物技术(北京)有限公司，2%茚三酮溶液、芦丁标准品购于生工生物工程(上海)股份有限公司，儿茶素类标准品购于北京华威锐科化工有限公司.除乙腈、甲酸和儿茶素类标准品为色谱纯外，其余试剂均为分析纯.

1.2 总糖质量浓度的测定

样品的总糖质量浓度测定采取可见光分光光度法[8].根据总糖检测试剂盒说明书，称取磨碎的花草茶叶样品0.1 g，加入1 mL 6 mol/L HCl溶液和1.5 mL蒸馏水，匀浆后沸水浴浸提0.5 h.加入1 mL 6 mol/L NaOH溶液，混匀后用蒸馏水定容至10 mL.8 500 r/min，离心半径为6.5 cm，25 ℃条件下离心10 min，取上清液.上清液稀释10倍加入150 μL DNS试剂混匀，沸水浴10 min后冷却至室温.最后加入900 μL蒸馏水混匀，540 nm下测定吸光值.另制备葡萄糖系列标准工作液，绘制标准曲线.样品吸光度代入标准曲线后换算总糖质量浓度.

1.3 总蛋白质量浓度的测定

采用改进的Bio-Rad蛋白质测定法进行总蛋白质量浓度测定[9].称取磨碎的花草茶样品1 g，用沸水配制成1 mg/mL的样品待测液.将蒸馏水与Bio-Rad蛋白质测定染料浓缩物按4∶1比例稀释.分别吸取1 mL Bio-Rad蛋白质测定染料浓缩物稀释液，加入2 μL样品待测液、蒸馏水和1 μg/μL牛血清蛋白标准品.摇匀后，在595 nm波长处测定吸光值.另制备牛血清蛋白系列标准工作液，绘制标准曲线.样品吸光度代入标准曲线后换算总蛋白质质量浓度.

1.4 游离氨基酸总质量浓度的测定

采用茚三酮比色法测定游离氨基酸总质量浓度[10].称取磨碎的花草茶样品3 g，加入450 mL蒸馏水，沸水浴45 min，每10 min晃动一次.浸提结束后立即减压过滤，用热蒸馏水洗涤2～3次残渣后，将滤液转入500 mL容量瓶中，冷却后定容.取1 mL上述滤液、0.5 mL pH8.0磷酸盐缓冲液及0.5 mL 2%茚三酮溶液于25 mL比色管中，沸水浴15 min后，冷却至室温，加蒸馏水定容至25 mL.静置10 min后，在570 nm波长处测定吸光度.另制备谷氨酸系列标准工作液，绘制标准曲线.样品吸光度代入标准曲线后换算游离氨基酸总质量浓度.

1.5 茶多酚质量浓度的测定

测定方法参考GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[11].称取磨碎的花草茶样品0.2 g，加入5 mL 70%甲醇水溶液，置于70 ℃水浴中浸提10 min，中途搅拌一次.冷却至室温后，3 500 r/min，离心半径为6.5 cm，离心10 min获得提取液及残渣.用70%甲醇水溶液按上述步骤浸提残渣一次，合并两次提取液后用0.45 μm膜过滤，取1 mL滤液定容至100 mL为样品待测液.取样品待测液1 mL，加入5 mL 10%福林酚试剂，于反应的4～8 min内加入4 mL 7.5% Na2CO3溶液，用蒸馏水定容并摇匀后于室温静置1 h，在765 nm波长条件下测定吸光度.另制备没食子酸系列标准工作液，绘制标准曲线.样品吸光度代入标准曲线后换算茶多酚质量浓度.

1.6 总黄酮质量浓度的测定

参考文献[12]，称取24.1 mg芦丁标准品和60%乙醇混合，用蒸馏水定容至50 mL，配制成482 μg/mL芦丁溶液.参考上述茶多酚质量浓度测定实验中的前处理方法进行样品前处理.取样品待测液1 mL，加入0.3 mL 5% NaNO3溶液，混匀后静置6 min，再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，混匀后静置6 min，再加入4 mL 4% NaOH溶液，混匀后静置15 min.用60%乙醇定容至10 mL，摇匀静置，15 min后于510 nm波长下测定吸光值.另制备芦丁系列标准工作液，绘制标准曲线.样品吸光度代入标准曲线后换算总黄酮质量浓度.

1.7 儿茶素类化合物质量浓度的测定

参考上述茶多酚质量浓度测定实验中的前处理方法进行样品前处理.酚类化合物标准溶液配制参考文献[12]：用甲醇将儿茶素(+C)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)分别配制成质量浓度梯度为10、50、100、250、500、1 000 μg/mL的标准液，绘制标准曲线.

HPLC检测条件参考文献[13]：使用可变波长紫外检测器(VWD)，设定检测波长为280 nm；采用Waters XTerraRP18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，设定色谱温度为30℃；流动相流速为1 mL/min；单次进样量为10 μL.选用的流动相1为0.5%甲酸水溶液，流动相2为乙腈.洗脱方式为梯度洗脱，在16 min内流动相2由6.5%线性增加至25%，到25 min时再回至初始状态，平衡10 min.每个样品进行3次重复的实验.样品吸光度代入标准曲线后，换算得到相应儿茶素化合物的质量浓度.

1.8 DPPH·清除法测定抗氧化活性

参考DPPH·清除法[14]，样品前处理方法参考上述茶多酚质量浓度测定实验中的前处理方法.4种花草茶的样品待测液分别用甲醇稀释10倍后，各取10 μL加入96孔酶标板，分别加入200 μL 200 μmol/L DPPH·溶液，于暗处静置30 min后,517 nm波长下测定吸光值.样品对照组用甲醇代替DPPH·溶液，空白对照组用甲醇代替样品待测液.

样品对DPPH·的清除率= l-[(A1-A2)/A0] ×100%，

式中,A1为样品测试液吸光值；A2为样品对照组吸光值；A0为空白对照组吸光值.

1.9 FRAP法测定抗氧化活性

参考文献[15]，样品前处理方法参考上述茶多酚质量浓度测定实验中的前处理方法.将0.3 mol/L醋酸缓冲液(pH=3.6)、20 mmol/L的FeCl3溶液和10 mmol/L的TPTZ溶液按10∶1∶1体积比配制成FRAP工作液.取150 μL FRAP工作液、15 μL蒸馏水至96孔酶标板，于暗处静置5 min.再各加入30 μL的4种花草茶样品待测液，于暗处静置30 min后,595 nm波长下测定吸光值.样品对照组用超纯水代替FRAP工作液，空白对照组用甲醇代替样品待测液.另制备FeSO4系列标准工作液，绘制标准曲线.样品吸光度代入标准曲线后，换算FeSO4质量浓度.

1.10 数据统计与分析

数据统计与分析使用SPSS软件，样本间比较运用邓肯(Duncan)多重范围检验，P<0.05表示差异有统计学意义.

2 结果与分析

2.1 花草茶的总糖质量浓度

由图1可知，贡菊花茶总糖质量浓度在4种样品中最高，达到0.376 mg/mL；玫瑰花茶总糖质量浓度最低(0.150 mg/mL)；金银花茶(0.337 mg/mL)与茉莉花茶(0.332 mg/mL)的总糖质量浓度比较差异无统计学意义(P=0.125).

图1 4种花草茶总糖质量浓度Fig.1 Concentration of total sugar in four herbal teas

2.2 花草茶的总蛋白质量浓度

4种花草茶的总蛋白质量浓度比较，差异无统计学意义(P=0.064)，其中玫瑰花茶的总蛋白质量浓度(0.286 mg/mL)略高于其他3种花草茶，见图2.研究表明，可食用花中的蛋白质含量丰富，菊花和玫瑰花中的蛋白质质量分数均超过10%[16].本研究中金银花与茉莉花的蛋白质质量分数均超过10%.

2.3 花草茶的游离氨基酸总质量浓度

4种花草茶中游离氨基酸总质量浓度由高至低依次为玫瑰花茶(0.122 0 mg/mL)、贡菊花茶(0.096 0 mg/mL)、金银花茶(0.069 6 mg/mL)和茉莉花茶(0.064 9 mg/mL)，见图3.其中，金银花茶与茉莉花茶的游离氨基酸总质量浓度比较，差异无统计学意义(P=0.263).4种花草茶均含有一定量的游离氨基酸，但均低于文献[16]报道的抹茶和绿茶等的游离氨基酸浓度，提示不同品种的茶叶游离氨基酸浓度差异较大.

2.4 花草茶的茶多酚质量浓度

玫瑰花茶的茶多酚质量浓度在4种花草茶中最高，达到35.9 mg/L；金银花茶(6.61 mg/L)次之；茉莉花茶(2.84 mg/L)与贡菊花茶(2.29 mg/L)的茶多酚质量浓度分别位列第三和第四，玫瑰花茶茶多酚质量浓度远高于其余3种花草茶(图4).茶多酚是茶叶或茶饮料中的天然抗氧化剂，4种花草茶中茶多酚质量浓度不同主要与其加工方式有关.花草茶属于不发酵茶，部分花草茶通过杀青步骤使多酚氧化酶失活，因此茶多酚质量浓度较高[16].

2.5 花草茶的总黄酮质量浓度

由图5可知，4种样品中总黄酮最丰富的是玫瑰花茶(0.639 mg/L)，是其余3种的2倍以上；其次为金银花茶和贡菊花茶，二者均为0.271 mg/L；茉莉花茶最低(0.245 mg/L)，茉莉花茶分别与金银花茶、贡菊花茶的总黄酮质量浓度比较，差异均有统计学意义(P<0.000 1).食用花中的黄酮类物质种类各不相同，有芦丁、槲皮素、芹菜素和山奈酚等.不同种类花草茶所含黄酮类物质的种类、结构及质量浓度有差别[16].

2.6 花草茶的儿茶素类化合物质量浓度

由表1可知，玫瑰花茶中的5种儿茶素类化合物质量浓度均远超过其余3种花草茶(P<0.000 1)，只有在玫瑰花茶中检测出表没食子儿茶素(EGC).茉莉花茶的5种儿茶素类化合物总质量浓度高于贡菊花茶，金银花茶的最少.花草茶的品种、生长环境、采摘条件以及加工方式等对儿茶素类化合物存在影响[13]，因此4种花草茶中儿茶素类组分构成及质量浓度不同.

表1 4种花草茶儿茶素类化合物质量浓度Tab.1 Concentration of catechins in four herbal teas

2.7 花草茶的抗氧化活性

由图6可知，4种花草茶中，玫瑰花茶对DPPH·的清除率远高于其余3种，达到18.4%，贡菊花茶的清除率极低，仅0.60%，金银花茶和茉莉花茶则分别为4.87%、4.96%.在FRAP法检测中，玫瑰花茶的抗氧化活性最强(11.1 mmoL/L)，金银花茶(7.19 mmoL/L)、茉莉花茶(5.92 mmoL/L)、贡菊花茶(5.50 mmoL/L)的抗氧化活性依次降低，差异有统计学意义(P<0.000 1).4种花草茶的抗氧化能力强弱排序为玫瑰花茶>金银花茶>茉莉花茶>贡菊花茶.

图6 4种花草茶DPPH·清除率和FRAP法抗氧化活性

2.8 花草茶的抗氧化活性与其主要品质化学成分间的相关性分析

分析4种花草茶中主要品质化学成分含量与其抗氧化活性之间的相关性，结果表明，茉莉花茶中EGCG质量浓度与FRAP值呈正相关(r=0.998，P<0.05)，贡菊花茶中+C以及总糖质量浓度与DPPH自由基清除能力均呈负相关(r=-0.997，-0.998；P<0.05)，提示不同种类花草茶中发挥抗氧化活性的主要物质基础不完全相同，后续需要增大实验样本量，进一步分析并确定4种花草茶中发挥抗氧化活性的物质基础.

3 讨论

本研究主要测定比较了4种花草茶的总糖、总蛋白质、总游离氨基酸、茶多酚、总黄酮、儿茶素类化合物的质量浓度，并分析与花草茶抗氧化活性的关联性.结果显示，总糖质量浓度：贡菊花茶>金银花茶≈茉莉花茶>玫瑰花茶；总蛋白质量浓度：玫瑰花茶≈金银花茶>茉莉花茶>贡菊花茶；游离氨基酸总质量浓度：玫瑰花茶>贡菊花茶>金银花茶≈茉莉花茶；茶多酚质量浓度：玫瑰花茶>金银花茶>茉莉花茶>贡菊花茶；总黄酮质量浓度：玫瑰花茶>金银花茶=贡菊花茶>茉莉花茶；儿茶素类化合物总质量浓度：玫瑰花茶>茉莉花茶>贡菊花茶>金银花茶；抗氧化活性：玫瑰花茶>金银花茶>茉莉花茶>贡菊花茶.

相关研究表明,茶多酚质量浓度可能和抗氧化活性存在一定相关性[17-20].Park等[21]研究玫瑰花提取物抗氧化能力时发现，多种多酚具有良好抗氧化作用，能达到有效清除DPPH·的效果；Qin等[22]在玫瑰茶泡液的20种成分中鉴定并验证了丁香酚为抗氧化成分；陈金娥等[23]在绿茶、红茶和乌龙茶活性成分的抗氧化性研究中发现，茶多酚质量浓度与抗氧化活性之间有显著相关，并可能呈一定的量效关系.本研究发现，茉莉花茶中EGCG质量浓度、贡菊花茶中+C以及总糖质量浓度分别与其抗氧化活性之间显著相关.不同种类花草茶中发挥抗氧化活性的主要物质基础有待进一步确证.

儿茶素类化合物属于黄酮类成分，黄酮类成分是玫瑰花中发挥抗氧化功能的重要活性物质之一[2].茶叶中的儿茶素类主要包括+C、EC、ECG、EGC、EGCG等[23].杨虎等[24]研究了玫瑰内黄酮清除DPPH·的情况，结果显示其清除DPPH·的能力略小于VC，与VE相近，说明玫瑰花茶的强抗氧化能力与其总黄酮质量浓度有一定联系.本研究结果显示，在儿茶素类化合物成分中，茉莉花茶EGCG质量浓度与FRAP值呈显著正相关，贡菊花茶+C质量浓度与DPPH自由基清除能力呈显著负相关.成品茶的抗氧化能力不同，可能是由于儿茶素浓度的差异[25].玫瑰花茶抗氧化活性远大于其余3种花草茶可能是因为其所含儿茶素类化合物成分比例不同导致的结果.不同种类花草茶的儿茶素类组成存在差异，对抗氧化活性的影响也会不同.

花草茶的总体抗氧化能力是其内部各种物质协同作用的结果.茶叶中的多酚类物质除去儿茶素类之外，还有山奈酚、槲皮素等，并且其中还存在茶多糖、茶氨酸等物质，也会影响其抗氧化能力[26].茶多酚的主要成分之间可能存在一定的相互作用，会加强或抑制花草茶的总体抗氧化活性，但其具体的作用机理还有待进一步实验研究.此外，尽管本实验使用了DPPH·清除法和FRAP法测定花草茶对体外自由基的清除率，但仍无法与真实生物体内的各种生物酶和活性氧自由基的反应作用完全一致.