子宫颈肿瘤患者HPV-E6/E7 mRNA表达的临床意义

张一帆 王艳茹 赵琴

宫颈癌是女性常见肿瘤，目前尚未完全阐明宫颈癌发病机制，但多项研究均证实［1-3］，人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是宫颈肿瘤发生的独立危险因素。基础研究显示［4］，HPV 基因中包含非编码区、晚期区及早期区，E6及E7属HPV 早期区基因，在HPV 病毒转录、翻译过程中发挥重要作用，是HPV 致癌机制中的关键点。相关研究显示［5］，E6及E7编码的致癌蛋白可与多种因子相互作用，参与宫颈癌的发生及发展。既往研究显示［6］，HPV-E6/E7 mRNA 的定性分析可用于宫颈肿瘤的鉴别诊断，区分宫颈上皮内瘤变（Cervical intraepithelial neoplasia，CIN）与宫颈癌。本研究中对子宫颈肿瘤患者的HPV-E6/E7 mRNA 进行定量分析，探讨其在不同疾病严重程度患者中的表达差异，分析其对宫颈肿瘤的诊断价值，为宫颈癌的防治提供一定参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年1月至2021年12月在平顶山市妇幼保健院经阴道镜下宫颈活检的102 例患者作为研究对象，根据活检结果，患者分为宫颈癌浸润组（21例）、CINⅢ级组（33 例）、CINⅡ级组（29 例）及CINⅠ级组（19 例），选择慢性宫颈炎女性40 例设置为对照组，宫颈癌浸润组患者年龄26～67 岁，平均年龄（42.48±5.43）岁，经产妇18 例，非经产妇3 例；CINⅢ级组患者年龄28～64 岁，平均年龄（41.42±4.52）岁，经产妇29 例，非经产妇4 例；CINⅡ级组患者年龄24～58 岁，平均年龄（43.52±6.22）岁，经产妇21 例，非经产妇8 例；CINⅠ级组患者年龄22～61 岁，平均年龄（42.96±6.24）岁，经产妇16 例，非经产妇3 例；对照组为慢性宫颈炎患者，年龄24～58 岁，平均年龄（41.63±5.23）岁，经产妇27 例，非经产妇13 例。各组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

纳入标准：CIN 及宫颈癌参考《中国子宫颈癌综合防治指南》中相关标准［7］，经病理学检查确诊；慢性宫颈炎参考《中华妇产科学》中相关标准［8］，经妇科检查及白带检查确诊；所有患者未接受过放疗及化疗治疗；入组前无宫颈癌及CIN 病史；临床资料完整；经医院医学伦理委员会批准。排除标准：子宫颈外科手术史；入组前1 个月内接受过抗菌治疗、抗病毒治疗者；妊娠期或哺乳期女性；入组前接受过免疫治疗者；自身免疫性疾病患者；合并其他部位恶性肿瘤者；合并肝肾功能障碍者。本研究中受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

①宫颈液基薄层细胞学（thinprep cytology test，TCT）检查：检查前3 d 内禁止性生活，禁止阴道冲洗及阴道用药，且检查避开月经期；将专用宫颈细胞毛刷在宫颈内顺时针旋转6 周左右，采集宫颈管脱落上皮细胞并保存在专用液瓶中，编号后封存；使用全自动细胞制片机（购自湖北孝感阔海医疗科技有限公司，型号：KCT-10）制片，参考TBS分级系统［9］，将TCT 结果分为：鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）；高级别鳞状CIN（High grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）；低级别鳞状CIN（Low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）；意义不明确的非典型鳞状细胞（Atypical squamous cells of undetermined significances，ASC-US）；不典型鳞状细胞（Atypical squamous cells：cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion，ASC-H）；无恶性改变及上皮病变（Negative for malignant lesions or intraepithelial lesions，NSIL）。②HPV-E6/E7 mRNA 检测：将待检标本放置于离心机（购自美国贝克曼公司，型号：C800），离心半径13 cm，转速3 000 r/min，离心15 min后弃上清液，加入细胞裂解液，添加蛋白酶K，分离组蛋白；而后摇匀标本，放置恒温箱保存2 h，使用捕获探针捕获HPV-E6/E7 mRNA，放大信号3 级，进行底物发光反应，观察发光信号强度，使用冷光检测仪检测mRNA 数量，经软件计算，数量与信号强度呈正比，拷贝数在0 以上时判定为阳性。

1.3 统计学方法

所有统计学资料录入SPSS 23.0 软件包，计量资料满足正态分布，采用（±s）表示，多组间的差异采用单因素方差分析进行比较，多组两两间的差异采用SNK-q比较；HPV-E6/E7 mRNA 与患者病变程度的关系使用Pearson相关性分析进行检验；使用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析HPV-E6/E7 mRNA 对各疾病的诊断价值；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HPV-E6/E7 mRNA 表达水平的比较

HPV-E6/E7 mRNA 表达水平：宫颈癌组＞CINⅢ组＞CINⅡ组＞CINⅠ组＞对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组HPV-E6/E7 mRNA 表达水平的比较（±s）Table 1 Comparison of HPV-E6/E7 mRNA expression levels in each group（±s）

表1 各组HPV-E6/E7 mRNA 表达水平的比较（±s）Table 1 Comparison of HPV-E6/E7 mRNA expression levels in each group（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05，与CINⅠ组比较，bP＜0.05，与CINⅡ组比较，cP＜0.05，与CINⅢ组比较，dP＜0.05。

组别对照组CINⅠ组CINⅡ组CINⅢ组宫颈癌组F 值P 值n HPV-E6/E7 mRNA［lg（copies/mL）］40 19 29 33 21 1.96±0.15 2.95±0.42a 3.68±0.32ab 4.62±0.85abc 5.14±0.95abcd 53.734 0.000

2.2 HPV-E6/E7 mRNA 表达水平与疾病严重程度的关系

随TBS 分级的降低，HPV-E6/E7 mRNA 水平呈降低趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。HPVE6/E7 mRNA：SCC 组＞HSIL 组＞LSIL 组＞ASC-US组＞ASC-H 组＞NSIL 组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。Pearson 相关性分析结果显示，HPV-E6/E7 mRNA 表达水平与疾病严重程度呈正相关（r=0.525，P=0.007）。见表2。

表2 HPV-E6/E7 mRNA 表达水平与疾病严重程度的关系（±s）Table 2 Relationship between HPV-E6/E7 mRNA expression levels and disease severity（±s）

表2 HPV-E6/E7 mRNA 表达水平与疾病严重程度的关系（±s）Table 2 Relationship between HPV-E6/E7 mRNA expression levels and disease severity（±s）

注：与SCC 比较，aP＜0.05，与HSIL 比较，bP＜0.05，与LSIL 比较，cP＜0.05，与ASC-US 比较，dP＜0.05，与ASC-H 比较，eP＜0.05。

疾病严重程度SCC HSIL LSIL ASC-US ASC-H NSIL F 值P 值n HPV-E6/E7 mRNA［lg（copies/mL）］21 23 21 19 18 40 5.37±1.53 4.78±0.85a 3.79±0.44ab 3.15±0.51abc 2.06±0.24abcd 1.46±0.09abcde 94.952 0.000

2.3 HPV-E6/E7 mRNA 对宫颈肿瘤的诊断价值

HPV-E6/E7 mRNA 鉴别诊断慢性宫颈炎与CIN 的曲线下面积（area under curve，AUC）为0.747，最佳截断值为2.35lg（copies/mL），此时诊断敏感度为0.786，特异度为0.846，95%CI为0.652～0.841；HPV-E6/E7 mRNA 鉴别诊断宫颈癌与CIN的AUC 为0.711，此时诊断敏感度为0.609，特异度为0.883，最佳截断值为4.69lg（copies/mL），95%CI为0.617～0.805（P＜0.05）。见图1。

图1 ROC 曲线Figure 1 The ROC curve

3 讨论

多项研究显示［10-12］，由癌前病变发展成为宫颈癌所需时间较长，故开展宫颈癌的早期筛查具有重要意义。临床上常采用TCT 进行宫颈癌的筛查，具有无创、操作简便等优势，但受操作者的涂片操作质量、阅片经验等影响较大，存在假阴性高等不足。HPV 感染是宫颈癌发生发展的重要危险因素，且与多种宫颈疾病相关，既往研究显示［13］，HPV 感染能够辅助筛查宫颈癌，其操作便捷性与TCT 相当。随着相关研究的不断深入，目前发现宫颈上皮细胞的持续性HPV 感染才可诱发宫颈癌，联合进行HPV 筛查具有较高的假阳性率，易造成医疗资源的浪费。故目前寻找更有效的宫颈癌筛查方法成为了临床探索的重点。

本研究中使用原位杂交技术定量检测了CIN、慢性宫颈炎及宫颈癌患者的HPV-E6/E7 mRNA 表达情况，结果显示，宫颈癌组的HPV-E6/E7 mRNA表达水平＞CINⅢ组＞CINⅡ组＞CINⅠ组＞对照组，差异有统计学意义，提示HPV-E6/E7 mRNA 的表达在不同宫颈病变患者中存在差异性，对于判断宫颈病变具有一定意义。国内莫小亮等研究显示［14］，HPV的阳性率及E6/E7 mRNA 的表达水平随着宫颈病变的级别升高而升高，与本研究结果类似。本研究结果显示，随TBS 分级的降低，HPV-E6/E7 mRNA水平呈降低趋势，差异有统计学意义。研究称［15］，TBS 分级是一种基于阴道/宫颈细胞学的诊断技术，其根据宫颈细胞病变程度进行分级，筛查宫颈癌具有较高特异性。本研究结果提示HPV-E6/E7 mRNA 水平检测与TBS 分级具有一定相关性，检测HPV-E6/E7 mRNA 水平能判断宫颈病变患者的细胞病变程度。本研究结果显示，SCC 组、HSIL 组、LSIL 组、ASC-US 组、ASC-H 组及NSIL 组的HPVE6/E7 mRNA 表达水平依次降低，且各组间差异均有统计学意义，Pearson 相关性分析结果显示，HPV-E6/E7 mRNA 表达水平与宫颈疾病严重程度呈正相关。本研究结果提示HPV-E6/E7 mRNA 水平随着宫颈疾病病变程度的加重而升高，基础研究显示［16］，HPV 持续感染是宫颈癌的重要病因，与HPV 基因编码区的早期基因区E6及E7相关，大量HPV 被持续性转录成为HPV-E6/E7 mRNA 时，宫颈癌的风险成倍数上升。研究显示［17］，HPV-E6 基因编码的E6 蛋白能够特异性结合癌基因p53的产物，使P53 蛋白快速降解，引起周围细胞失控，产生类似P53基因突变的效应，具有较强致癌作用。此外有研究证实［18］，E6 蛋白还能降解正常细胞内的PDZ 蛋白，抑制细胞黏附，促进宫颈癌发展。而E7蛋白可与视网膜母细胞瘤蛋白结合，使转录因子激活腺病毒E2，造成细胞周围失控，发挥促进细胞恶性增殖的作用。本研究中进一步分析了HPV-E6/E7 mRNA 水平检测对宫颈疾病的诊断价值，结果显示，HPV-E6/E7 mRNA 在鉴别诊断慢性宫颈炎与CIN及宫颈癌与CIN 中均具有一定价值，提示HPV-E6/E7 mRNA 检测可作为TCT 检查结果的补充。

综上所述，HPV-E6/E7 mRNA 在宫颈肿瘤患者中呈高水平表达，且表达水平随着疾病严重程度的增加而增加，检测HPV-E6/E7 mRNA 的表达可鉴别诊断慢性宫颈炎、CIN 及宫颈癌。