建立一种高灵敏的HBV核酸定量检测方法

李卓 于海涛 高娟 黄燕

全球范围内约有2.5 亿人感染慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）［1］。感染HBV 后，约有15～40%会进展为肝硬化、肝衰竭甚至肝癌［1-2］，每年导致近100 万人死亡。我国人群HBV 携带率约为10%，有超过1 亿的无症状病毒携带者以及2 000 多万慢性乙肝患者［3］，给社会经济和医疗带来巨大负担。

准确诊断联合预防策略，对于指导患者管理以及控制HBV 向易感人群的传播尤为重要，HBV核酸定量检测是评价疗效和预后最常用的方法［4-6］。目前，国内已有很多商品化的HBV 核酸检测试剂盒，但由于不同试剂盒往往针对病毒核酸不同位点，检测性能差别较大，灵敏度和特异性难以满足临床需求［7］。本研究拟建立一种灵敏度高、特异性强、操作简便、更适用于临床的HBV 核酸定量检测方法，全面评估该方法的灵敏度、特异性和重复性，同时与另外一种普遍使用的HBV 核酸检测试剂盒进行比较，从而评价该方法的临床性能。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2020年2月至2021年6月来自中南大学湘雅医院、浙江大学医学院附属邵逸夫医院和西安医学院第一附属医院，共计631 例样本，包括血浆60例，血清571 例（其中60 例与血浆样本为同一来源）。所有参与单位均通过医学伦理部门审核同意。

1.2 仪器与试剂

采用西安天隆科技有限公司生产的全自动核酸提取仪及其配套的核酸提取或纯化试剂盒（批号：PANA9600S）进行核酸提取；采用A 公司生产的“乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒（PCR-荧光探针法）”（批号：2019008）作为对照试剂；B 公司生产的“乙型肝炎病毒（HBV）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）”（批号：C0010481902）作为复核试剂；qPCR 预混液、Taq DNA 聚合酶及UNG 酶，均来自西安天隆科技有限公司（批号：P1662001001）；实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司（Thermo Fisher，AB1 7500）。

1.3 方法

1.3.1 核酸提取及浓度测定

所有采集的血清和血浆样本，采用全自动核酸提取仪及其配套试剂盒进行DNA 提取，并用紫外分光光度计检测DNA 浓度和质量。

1.3.2 HBV 核酸定量检测方法

①引物及探针的设计：选用HBV 病毒保守基因片段设计引物及特异TaqMan 探针，并利用Primer Express 软件设计一段人工合成的非竞争性序列为内标模板，设计引物探针，内标探针选用VIC 通道荧光标记；②TaqMan 实时荧光PCR 进行HBV 核酸定量检测：配制PCR 反应液，包括qPCR预混液，4.2 μL 引物探针混合液，0.4 μL Taq DNA聚合酶，0.4 μL UNG 酶。向反应液中分别加入20 μL HBV 质控品或定量标准品，以及样品DNA。PCR 扩增程序为：50℃2 min，95℃3 min，随后94℃15 s，55℃15 s，最后72℃15 s，共5 个循环；随后94℃15 s，60℃30 s，共40 个循环。目标基因FAM 通道的Ct 值＜35，内标VIC 通道的Ct 值＜40，则判断该样本为HBV 阳性，否则为阴性。HBV 强阳性质控品Ct 值应小于20，HBV 临界阳性质控品Ct 值应在25～30 之间，HBV 阴性质控品Ct 值无数据且内标Ct 值＜40。

1.3.3 灵敏度分析

采用灭活的人源HBV 阴性血清和血浆样本，将HBV 核酸国家标准品（300022-201601）血清及血浆样本稀释，制备K1（20 IU/mL）、K2（15 IU/mL）、K3（10 IU/mL）、K4（5 IU/ mL）、K5（2.5 IU/ mL）样本，对样品中的HBV 进行定量检测，每份样本重复检测24 次，分三天进行。计算检出率和Ct 值的变异系数（CV，%）。

1.3.4 重复性分析

采用灭活的人HBV 阴性血浆样本，将商品化的HBV 血浆（包含HBV A～H 型别）按型别分别稀释，制备成强阳性样本（5 log IU/mL）、弱阳性样本（2 log IU/mL）、临界阳性样本（1.3 log IU/mL）。所有样本在不同时间重复检测，每个样本共重复20 次，计算检出率及Ct 值的变异系数（CV，%）。

1.3.5 特异性分析

采用干扰物添加方法进行特异性分析。①收集可能与HBV 存在交叉的15 种临床样本，包括丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人类疱疹病毒Ⅳ型、人巨细胞病毒、甲型肝炎病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型、单纯疱疹病毒Ⅱ型、结核分枝杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、人类免疫缺陷病毒、梅毒、甲型流感病毒、痤疮丙酸杆菌和人类疱疹病毒Ⅵ型等样本，经确认为HBV 阴性。细菌感染的水平为106cfu/mL 或更高，病毒为105pfu/mL 或更高。所有样本重复检测3 次；②内源性干扰：采用正常血清和含有30 mg/mL 游离血红蛋白、60 mg/mL 甘油三酯、0.6 mg/mL 胆红素、40 mg/mLIgG 及80 IU/mL类风湿因子的血清样品，分别制备HBV 终浓度为30 IU/mL 的血清，重复检测5 次；③外源性干扰：针对HBV 常用治疗药物，采用正常的血浆和含有300 U/mL 干扰素α，4.5 μg/mL 拉米夫定，75 ng/mL阿德福韦酯，15 μg/mL 替比夫定，50 ng/mL 恩替卡韦的血浆，制备至终浓度30 IU/mL，重复3 次。

1.3.6 乙型肝炎病毒核酸定量检测的对照分析及结果复核

对照试剂采用A 公司生产的HBV 核酸测定试剂盒（检测下限为500 copies/mL），所有血清和血浆样本采用本文提出的HBV 核酸定量检测方法和对照试剂盒同时进行检测，结果不一致的样本采用B 公司生产的HBV 核酸检测试剂盒（检测下限为5 IU/mL）进行复核检测。

1.3.7 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析；计量资料用（±s）表示，计数资料以（%）表示；采用Passing-Bablok 回归分析进行一致性评价和Kappa统计分析，评估HBV 核酸定量检测方法的临床性能；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV 核酸定量检测方法的灵敏度及重复性评估

HBV 核酸定量检测方法对标准品中5 IU/mL的血清（图1A）和血浆样本（图1B）的检出率均为100%，检测CV≤5%，且与理论值浓度偏差≤0.5，重复性检测结果，强阳性样本、弱阳性样本和临界阳性样本的阳性检出率均为100%，且所有样本的Ct值的CV 值均≤5%。见表1。

表1 HBV 分型检测结果Table 1 Results of the HBV subtyping test

图1 HBV DNA 定量检测方法对血清和血浆样本的检测灵敏度分析结果Figure 1 Results of the sensitivity of the HBV DNA quantification method for serum and plasma samples

2.2 HBV 核酸定量检测方法的特异性评估

15 份感染其他病原体的样本结果均为阴性，无交叉反应。30 mg/mL 游离血红蛋白、60 mg/mL甘油三酯、0.6 mg/mL 胆红素、40 mg/mL 总G 型免疫蛋白（IgG）及800 IU/mL 的类风湿因子的Ct 值与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2A。300 U/mL IFNα，4.5 μg/mL 拉米夫定，75 ng/mL 阿德福韦酯，15 μg/mL 替比夫定，50 ng/mL恩替卡韦的Ct 值与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2B。

图2 HBV DNA 定量检测方法与不同干扰物的交叉反应结果Figure 2 Results of the cross-reaction of HBV DNA quantitative method with different distractors

2.3 HBV 核酸定量检测方法与对照试剂盒定性分析的一致性比较

571 例样本中有6 例血清样本在使用本研究建立的HBV 核酸定量检测方法与对照试剂盒时检测结果不一致，本法检测结果判定为阳性，对照试剂盒检测结果为阴性，采用复核试剂盒进行检测，结果6 例样本均为阳性，与本文建立的方法检测结果一致。见表2。

60 例血浆样本中1 例检测结果在使用本研究建立的HBV 核酸定量检测方法时为阴性，对照试剂盒检测为阳性，结果不一致（表2-样本编号：X245），经复核为阴性，与本文建立的方法检测结果一致。

表2 检测结果不一致样本的复核检测Table 2 Retesting of samples with inconsistent results

2.4 HBV 核酸定量检测方法与对照试剂盒定量分析的一致性比较

血浆样本的检测差异均值为0.021 2。见图3A。血清样本的检测差异均值为-0.011 3。见图3B。针对血清和血浆样本，对照试剂盒与本文建立的HBV 定量检测方法（考核试剂）的一致性限的范围分别为（-0.312 8～0.355 2）和（-0.337 3～0.314 6），在临床认可标准范围内（-0.4～0.4）；回归分析显示，两者的线性度无明显偏差；但两种样本的检测结果有统计学意义（P均＜0.05）。

图3 HBV 核酸定量检测方法与对照试剂盒定量分析的一致性比较Figure 3 Comparison of agreement between the HBV quantitative methods and control kits

3 讨论

HBV DNA 载量通常被认为是衡量病毒复制情况的“金标准”，与临床上乙肝的疾病活动度和传染性密切相关［8-10］。欧洲肝病研究学会指南指出HBV DNA 载量应尽可能控制在10～15 IU/mL，并建议其最低检测限为30 IU/mL［11］。目前，我国的HBV DNA 检测多为基于煮沸法进行PCR检测，耗时较长，灵敏度低，检测限普遍为500～1 000 IU/mL，因此临床普遍采用进口的高敏检测试剂盒，虽然重复性好但价格昂贵。本文建立了一种基于Taqman 探针的定量PCR 检测方法，具有以下优势：一、检测通量大，仅需2 h 可同时检测94份标本；二、灵敏度高，重复性好，能有效区分不同亚型和不同阳性程度的HBV 样本；三、全程闭管，可有效避免污染；四、特异性高，与干扰物无交叉反应。且采用双荧光通道，检测结果直观，便于临床推广。

为进一步评价其临床性能，本研究还与目前市场占有率较高的常规HBV DNA 检测试剂盒进行了比较，结果发现：一、该方法灵敏度高，检测限低至5 IU/mL，对HBVA-H 型强阳性、弱阳性和临界阳性样本的检出率均为100%；二、特异性高，可能存在交叉反应的15种病原体对检测结果均无影响；三、该方法与对照试剂的一致性分析比较发现存在个别样本检测结果不一致，后经过复核试剂确认和本法结果一致。其中，结果不一致的6例血清样本均为低浓度样本，因为不同检测方法存在检测灵敏度的差异，可能是导致对照试剂出现假阴性结果的原因；另有1例血浆样本，考核试剂检测为阴性，而对照试剂则为阳性，经复核结果与考核试剂一致，表明本文建立方法准确性高，具有较好的临床应用价值。

综上，本研究开发的HBV 核酸定量检测方法具有较高的灵敏度和特异性，能够有效区分不同的病毒亚型，性能符合临床要求，有望为乙肝的临床诊断提供一种新的实验室检测方法和参考依据。