早期鼻咽癌外周血EB病毒相关分子诊断标志物研究进展

邢利 任明君 唐石伏

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是东亚和东南亚（包括中国南方地区）流行的地方性恶性肿瘤之一［1］。据世界卫生组织最新统计，中国人群NPC 发病率明显高于世界平均水平，新发病例数占全球总NPC 人数的46.91%。NPC 对放射治疗敏感，因此随着放疗技术的不断提高，目前早期NPC 的5年总生存率（overall survival，OS）已达到90%［2］。在临床诊疗中，由于NPC 发病部位隐匿，发病症状体征与其他良性疾病的难以鉴别，70%NPC 患者确诊时已处于中晚期，转移和复发风险显著升高，死亡率急剧上升，预后不好［3］。目前发病机制尚不明确，现广泛认为NPC 是宿主细胞、EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染和肿瘤微环境等因素长期相互作用、不断演化的结果［4］。其中EBV 被公认为是NPC 的主要危险因素［5］，因此与EBV 有关的生物标志物常被应用于临床辅助诊断NPC。本文通过分析各种EBV 相关标志物与早期NPC 的相关性，以帮助阐明其在早期NPC 分子诊断方面的成就和不足。

1 EBV 血清抗体与NPC

EBV 是由Epstein 和Barr 在1964年发现的一种结构为双链线性DNA 的人类γ 疱疹病毒，长约172 kb，主要通过唾液传播，以潜伏感染的形式存在人B 淋巴细胞和鼻咽上皮细胞中，与NPC 等多种疾病密切相关［6］。EBV 生存周期分为潜伏期和裂解期，而裂解期又分为立即早期、早期、病毒DNA 复制期和晚期。不同时期表达相应的蛋白如潜伏膜蛋白1（Latent Membrane protein 1，LMP1）、BZLF1（BamHI Z left frame 1）基因编码的Zta（BZLF1 transcription activator，Zta）蛋白、BRLFl（BamHI Z left frame 1）基因编码的Rta（replication and transcription activator）蛋白、早期抗原（Early antibody，EA）等。美国学者Old 等［7］使用免疫扩散实验最先证实了EBV 抗体与NPC 有关。

1976年曾毅院士团队首次建立了免疫酶法用于检测衣壳抗原（capsid antigen，VCA）IgA 和EA-IgA，随后的大规模的血清学普查和追踪观察发现两种抗体联合检测对NPC 的早期诊断具有重大意义［8］。但单一抗体检测早期NPC 时EA-IgA敏感性低，而VCA-IgA 特异度较低。此外EBV 抗体谱中，机体对潜伏基因编码的蛋白产生的免疫应答产物Rta-IgG 对于早期NPC 的具有较高准确性［9］，而Zta 蛋白抗体需要大规模临床应用才能评价。EBV 核抗原（nucleus antigen，NA）作为NPC增殖后期产生的结构蛋白，对早期NPC 诊断也具有一定的价值。YU 等［10］发现在早期患者血清中，EBNA1-IgA 的灵敏度和特异度分别为0.778 和0.969。而LIU 等［11］在106 例早期NPC 患者血浆中检测到EBNA1-IgA 敏感性为0.915，特异性为0.987，同时提出单一的EBNA1-IgA 有望成为早期NPC 有前途的标记物。以上的EBV 血清抗体敏感性和特异性均较高，但是阳性预测值多在1%～5%，因此单一抗体在早期NPC 筛查及诊断应用中依然存在局限性。

2 血浆EB 病毒DNA

血浆中EBV-DNA 可能是从NPC 细胞凋亡过程中释放，或由病毒复制产生。Lo 等［12］运用RT-qPCR 技术检测NPC 患者血浆中EB 病毒EBNA-1 和BamHI-W 两个片段的拷贝数，发现晚期患者血浆中EBV-DNA 拷贝数明显高于早期患者，认为血浆EBV-DNA 定量快速、准确，适用于高危地区鼻咽癌的筛查。随后，多个实验室将单拷贝数的EBNA-1基因以及多拷贝数的BamHI-W基因作为检测对象，使用多种检测技术如qPCR、dPCR 等检测由NPC 细胞凋亡释放出的EB 病毒DNA 片段（＜181 个bp）。然而不同的实验室，不同的样品处理方法、不同的检测方法对EBV-DNA 的检出率均有影响。随后在2011年世界卫生组织发布了第一版EB 病毒扩增技术的国际标准［13］。

大量学者将EBV-DNA 应用于NPC 的早期诊断及筛查中，其中Chan 等［14］应用血浆EBV-DNA 筛查无症状患者并对第一次阳性的患者4 周后再次取血浆进行检测，仍呈阳性的309名受试者经病理确诊的NPC 患者共34 例，早期占71%。作为一项前瞻性研究，血浆EBV-DNA 诊断早期NPC 特异度及灵敏度均良好。但与其他实验室的检测结果相比明显较高，这或许是因为检测方法、检测对象及阈值的设定不同。近五年关于早期NPC 患者血浆EBV DNA 研究结果见表1。随后Chan等［15］还分析了NPC 患者血浆EBV DNA 的大小，并强调了ctDNA大小是的一个重要参数，对ctDNA 分析（包括大小图谱）的深入了解可能有助于其在癌症诊断中的全部潜力得以实现。

表1 近五年关于早期NPC 患者血浆EBV DNA 的研究数据比较Table 1 Comparison of research data on EBV DNA of patients with NPC in the past five years

血浆EBV DNA 目前广泛应用于NPC 的筛查、复发监测和预后。使用qPCR 技术检测BamHI-W基因在研究学者看来能够获得更高的灵敏度。但目前的研究存在一些不足：一、组织学亚型会影响DNA 结果：EBV 感染多与高发地区的非角化型NPC 相关，而角化型NPC 大多检测不到EBV 基因组。二、单次血浆EBV DNA 结果假阳性较高，需要采集两次血样并进行内镜检查及影像学检查，这会加重患者的心理负担。三、临床分期：对于较早期的NPC 即EBV 再激活即复制早期，细胞周转少，在凋亡/坏死过程中释放的EBV DNA 不足以在早期NPC 患者的血浆中检测到，这会导致假阴性结果的产生。综上所述血浆EBV DNA 对于早期NPC 患者的筛查价值有限。

3 EBV 编码的microRNA

EBV 是首个发现可以编码miRNAs 的病毒。EBV miRNAs 可作为病毒致癌基因诱导宿主细胞的基因突变和表观遗传改变，从而导致NPC 发生和进展［21］。目前已鉴定出25 个EBV相关的miRNA 前体和48 个miRNA 成熟体，分别由病毒基因组的两个区域BamHI-A 右向转录本（Bam HI-A region rightward transcript，BART）和BHRF1（Bam HI fragment H right ward pen reading frame 1）编码［22］。目前证明与NPC 发生相关的三种是miR-BART7、miR-BART13-3p 和miR-BART17。

miR-BART7 在未分化的NPC 细胞中和组织中高表达，具有潜在的诊断价值［23］。Wardana 等［24］在138 例早期患者中使用定量PCR 技术检测血浆EBV miR-BART7 和miR-BART13-3p 的表达，miRBART7 的AUC 值 为0.965，miR-BART13-3p 的AUC 值为0.980，这证实了血浆miR-BART7 和miR-BART13-3p 对早期NPC 患者的具有较高准确率。Gourzones 等［25］人发现在NPC 患者血浆标本中miR-BART17 明显增加，且miR-BART17 的显著增加伴随着一个患者肿瘤质量的增加，敏感性为77%，特异性可达90%。这提示血浆中miRBART17 的浓度可能与NPC 的进展有关。与EBV DNA 相比，血浆EBV miRNAs 可能更直接地反映了肿瘤的活性，这或许是因为EBV-miR-BARTs 作为病毒致癌基因在宿主细胞生存、免疫逃逸、细胞增殖、细胞凋亡和肿瘤代谢中发挥关键作用，促进NPC 的发生。但EBV miRNAs 目前仅处于实验阶段，并未进行大规模的验证，且检测质量影响因素存在、缺少大型前瞻性研究证据，方法学有待标准化等问题亟需解决。随着研究方法的改进，未来EBV microRNAs 检测有望成为早期NPC 潜在的分子标志物。

4 联合检测

从1970年开始，研究者们使用EA-IgA 和VCA-IgA 两项联合检测用于筛查中国南方NPC 高发地区的高危人群［8］。2008年Liu 共招募了28 688 人参与了血清学筛查实验，总体NPC 检出率为0.14%（41/28 688），随访第一年内早期诊断率为68.3%（28/41），但阳性预测值只有4.41%［26］。而Li等使用上述研究中的46 份NPC 血清以及263 份根据EBNA1-IgA 和VCA-IgA 结果被划分为高危参与者的血清样本检测EAD-IgA，称之为两步筛选方案，使高危人群从128 人降低为27 人，阳性预测值由4.69%提高至18.5%，仅遗漏一例极早期病例［27］。两步筛选法提高了特异性，且不会显著降低敏感性，使更多人避免了纤维内镜检查。目前越来越多的学者建议将血清学抗体与血浆DNA 联合检测在提高灵敏度和特异度的同时，将阳性预测值提高，得到更好的诊断效能。综上所述，使用EBV 血清学抗体及血浆DNA 联合检测，或建立血清学的预测模型是鼻咽癌的早期筛查策略之一，能够显著提高阳性预测值，减少不必要的内镜或影像学检查，近五年联合检测结果比较见表2。

表2 联合检测结果比较Table 2 Comparison of combined test results

酶联免疫吸附法作为目前最常用的EBV 血清学检测方法，简便快捷且经济成本低，常用于NPC高发地区筛查及诊断。目前有专家提出将血清学筛查与遗传学风险联合开发出了综合风险（comprehensive risk score，CRS）评分应用于鼻咽癌筛查，阳性预测值从4.70%（仅VCA-/EBNA1-IgA）增加到43.24%（CRS+VCA-/EBNA1-IgA），这为鼻咽癌的早期诊断及预后提供了有效的辨别模式［28］。总之EBV 血清抗体谱作为临床应用最广泛的分子标志物，单一抗体多存在灵敏度或特异度不足的缺陷，两种抗体联合检测多能满足临床需求但对于鼻咽癌早期筛查存在阳性预测值低的问题，而使用血清学检测与CRS 相结合则能有效提高阳性预测值，避免了大量非NPC 患者免受内镜及影像学检查的痛苦，是目前临床最高效的早期筛查手段之一。

5 总结与展望

EBV 在鼻咽上皮建立异常的潜伏感染，在多种因素的作用下裂解再激活诱导肿瘤微环境有助于NPC 的发展及维持，并因机体对肿瘤相关病毒的黏膜抗体应答，使得多种EBV 血清抗体、血浆EBV-DNA 及EBV 编码的miRNAs 成为了早期NPC 液体活检的分子诊断标志物及潜在分子标志物。近年来随着高通量测序及液体活检技术的广泛普及，越来越多的肿瘤循环RNA（circulating tumor RNA，ctRNA），例如长链非编码RNA 及环状RNA 在NPC 早期筛查诊断中扮演了重要的角色。相信随着研究方法的改进及大规模的验证，越来越多的新型分子诊断标志物能够应用于早期NPC 的筛查及诊断。