基于气相色谱-离子迁移谱分析海鸭蛋腌制过程中蛋清挥发性风味物质的变化

李明洁，凌 逍，李祥雨，夏 宁,*，滕建文，韦保耀，黄 丽，李伟丽

（1.广西大学轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004；2.广西朗盛食品科技有限公司，广西 南宁 530000）

海鸭蛋是广西沿海地区极具特色的地方食品资源，产自于以海边滩涂鱼、虾、蟹、贝类、藻类等为主食的海鸭，由于具有丰富的营养及特殊的风味，其鲜蛋产量及其加工产业规模占据全国海鸭蛋市场的半壁江山。目前广西海鸭蛋的主要初加工形式是进行红泥盐腌，该法腌制后的鸭蛋品质优良，主要体现出蛋黄口感松沙、色泽鲜艳、出油较多且风味咸香浓郁的蛋黄有利于产品的深加工等特点。海鸭蛋在腌制过程中通常以蛋黄的品质和风味判断腌制结束的终点，而忽略蛋清在腌制过程中品质及风味的变化，这也是咸蛋清腥味较重且含盐量高的主要原因。

目前国内外对鸭蛋腌制过程中的研究主要集中在腌制过程中理化性质的变化，包括蛋黄硬化率、出油率、水分迁移规律以及微观结构等影响，蛋清的含盐量、黏度、水分含量以及pH值等。海鸭蛋在腌制前后风味发生巨大变化，目前对鸭蛋在腌制过程中的风味研究主要集中在蛋黄风味的变化，包括咸蛋黄的特征风味、咸蛋黄腥味的来源、咸蛋黄熟制前后风味的变化规律等，但是针对咸蛋清腌制过程中风味物质变化的研究相对较少，难以全面对咸鸭蛋腌制过程中风味物质的变化进行分析。

气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是一种将GC与IMS联合起来的风味分析技术，由于其预处理简便、灵敏度高、可以常压工作等优势，能够对地理标志性产品的鉴别、分级、掺假鉴别、货架期判断及产品加工工艺的优化等进行快速分析。在对蛋品的风味物质研究上，可以利用其对新鲜鸡蛋的贮藏时间进行分类评估，建立模型对其贮藏时间进行拟合，区分出鸡蛋的货架期；也可以对蛋黄和蛋清中的挥发性风味物质进行检测，判断蛋清中主要挥发性风味物质为酯类化合物等。在利用GC-IMS对挥发性风味进行分析时常佐以构建模型及聚类分析等多元统计学方法，如利用正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）对海鲈鱼肉的蒸制过程进行区分并确定海鲈鱼肉不同过程的特征风味物质，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）和热图分析对不同加工方式的黑枣进行区分，利用PCA对猪肉的不同部位进行区分等。

因此，本实验利用感官评价和GC-IMS技术对海鸭蛋在红泥腌制过程中的咸蛋清的挥发性风味物质的变化进行鉴别、定性检测及相对定量的研究，结合PCA和OPLSDA等多元统计分析方法，找出不同腌制阶段的特征风味物质及异味物质的来源，为腌制过程中产品品质变化的控制和预警提供相关参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红泥腌制海鸭蛋（采用红泥与饱和食盐水质量比为1∶1的泥盐水，腌制温度为25～30 ℃），购于广西北海市蛋品厂。

2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮和2-壬酮（均为色谱纯） 上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2004电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；FlavourSpecGC-IMS仪 德国多特蒙德分析传感器系统有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

每5 d取红泥腌制的海鸭蛋10 枚，分离出咸蛋清，混匀。取1 mL咸蛋清置于5 mL离心管中，常温孵化30 min后进行感官评价。准确称取3.0 g置于20 mL顶空瓶中进行GC-IMS的测定。每个样品平行测定3 次。

1.3.2 感官评价

邀请15 名有丰富感官评定经验的人员组成感官评估小组，年龄在23～26 岁之间，其中女性9 名，男性6 名。感官评价采用10 分制原则，评定项目包括咸蛋清的颜色以及腥味，具体感官评价标准见表1。

表1 咸蛋清腥味感官评定表Table 1 Criteria for sensory evaluation of color and off-flavor of salted duck egg white

1.3.3 GC-IMS测定条件

自动进样条件：孵育温度60 ℃；孵育时间20 min；孵化器转速500 r/min；采用顶空不分流模式自动进样；进样针温度85 ℃；进样量500 μL。

GC条件：采用弱极性毛细管色谱柱FS-SE-54-CB-1（15 m×0.53 mm）；柱温45 ℃；载气为氮气（≥99.999%）。载气流量梯度，初始流速2 mL/min，持续5 min，然后在20 min内增加到70 mL/min，停留5 min，总GC运行时间为30 min。

IMS条件：漂移管温度45 ℃；漂移气为氮气（≥99.999%），漂移气流速150 mL/min。

1.4 数据处理

样品中的挥发性成分采用Library Search软件进行定性处理，LAV软件对物质进行采集，通过Reporter插件导出GC-IMS二维谱图，用Gallery Plot插件对比指纹图谱的差异。采用Origin 2021软件对样品进行PCA、SIMAC14.1软件对样品进行OPLS-DA，SPSS 26.0软件进行数据处理及显著性分析，＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 感官评价结果

从图1可以看出，腌制前20 d咸蛋清的颜色无显著性差异且分值低于3 分，属于无色透明状态，25 d后，咸蛋清颜色由无色透明转向浑浊较黄且均存在显著性差异。与此同时咸蛋清的风味也发生巨大变化，腌制前20 d咸蛋清腥味差异不大，25 d后咸蛋清腥味较为浓郁，说明咸蛋清在腌制25 d时品质发生巨大变化，颜色明显加深且腥味明显浓郁。颜色的转变可能是蛋黄腌制成熟后有出油现象，油脂渗透到咸蛋清中，导致咸蛋清的颜色和风味都发生巨大转变。

图1 海鸭蛋腌制过程中颜色和腥味的感官评价Fig. 1 Sensory evaluation scores of color and off-flavor of sea duck eggs during salting

2.2 海鸭蛋腌制过程中咸蛋清挥发性风味物质的GC-IMS图谱

在GC-IMS中，挥发性风味物质分别通过气相色谱柱和离子迁移管，发生双重分离，其中气相保留时间、离子迁移时间和保留指数用于对物质进行定性分析。按照取样时间点，将腌制过程分为8 个阶段，每个阶段横坐标表示离子相对迁移时间，在1.1～1.7之间，纵坐标表示风味物质在色谱中的气相保留时间，范围主要在100～800 s之间。谱图上每个斑点表示一种化合物，颜色越红，说明该化合物信号越强，对应浓度越大。由图2可知，在0～20 d图谱中斑点数量较少且颜色较浅，此时海鸭蛋清中风味物质较少且含量较低，当腌制到25 d时风味物质数量明显增多，对应信号强度也在增强，直至腌制结束挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）数量和信号强度都保持在一个较高水平。在25 d时液态的蛋黄已经凝固，蛋清黏度下降并体现出更浓郁的不良风味，此时感官判断鸭蛋基本达到腌制成熟的初期，但是在以蛋黄品质为腌制结束的标准中，为了追求咸蛋黄的饱满度，会适当延长腌制时间，过长的腌制时间会增加产品的劣变率，利用GC-IMS可以将产品的劣变程度与具体的挥发性风味物质部分联系起来，为识别产品的劣变程度提供可以参考的理论依据。

图2 海鸭蛋在腌制过程中咸蛋清VOCs的GC-IMS图谱Fig. 2 GC-IMS spectra of VOCs of sea duck egg white during salting

2.3 海鸭蛋腌制过程中咸蛋清VOCs的鉴定分析

通过GC-IMS鉴定出腌制过程中咸蛋清的VOCs种类如表2所示，共发现可以定性的化合物43 种，主要为醛类11 种、酮类10种、醇类9 种、酯类6 种、酸类5 种、杂环化合物1 种以及烯烃化合物1 种。这些VOCs的碳链主要集中在C～C之间，且由于浓度不同会产生单体和二聚体。使用面积归一化法对结果进行相对定量分析，酮类和酯类是咸蛋清腌制过程中主要的风味化合物，其次为酸类、醛类和醇类。

新鲜的海鸭蛋中酮类化合物相对含量最高，达到71.84%，在腌制过程中，其相对含量逐渐降低，酮类化合物的来源多种多样，但它们最常见的形成方式是脂质的氧化和美拉德反应；酯类化合物与此相反，在未腌制状态下为14.69%，5 d后相对含量骤升为65.54%，并在后续腌制过程中保持在一个较高水平，直到腌制25 d后，其他挥发性化合物含量都持续增加后，其相对含量仍然保持在35.49%，显然对咸蛋清的风味具有重要贡献；酸类化合物的相对含量在20～25 d之间由1.95%骤升至13.84%，表明酸类化合物在咸鸭蛋腌制成熟初期变化明显，也许是区分咸鸭蛋成熟的重要标志；醛类化合物在腌制过程的相对含量也由4.99%稳步上升为10.59%。

由表2可知，酮类化合物中2-丁酮含量最高，单体和二聚体总相对含量高达52.21%，其具有醚香、果香和清香。随着腌制时间的延长，2-丁酮含量持续降低，与此同时具有奶油香和乳香的3-羟基-2-丁酮含量持续升高，到腌制成熟时单体和多聚体占比之和达到15.42%。3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二酮通常存在于发酵食品和饮料（如葡萄酒）中，可通过微生物发酵作用产生，它们也可以通过美拉德反应形成。

酯类化合物的相对含量在腌制过程中一直处于一个较高的水平，直到腌制25 d以后，其他种类化合物含量都持续上升到较高水平，酯类相对含量占比降低到35.49%，而在酯类化合物中乙酸乙酯占比最高，在腌制5 d后相对含量高达62.40%，直到腌制完全成熟后，相对含量降低为32.79%，在卫慧萍等对咸蛋黄风味物质的检测中，也发现乙酸乙酯的含量占总挥发性物质的一半左右，这说明乙酸乙酯是咸鸭蛋中重要的挥发性成分，其可能带来咸鸭蛋特有的果香和酒香。

酸类化合物中相对含量较高的异丁酸和丙酸在腌制的前20 d没有显著变化，但到了腌制的后期，即腌制成熟后异丁酸的相对含量达到6.24%，丙酸相对含量高达4.64%。异丁酸在大部分食品中都体现出对食品风味的不良影响，如酸败味，黄油味等异味；而丙酸具有辛辣、豆子、酸败味，这些物质或许是咸蛋清中腥臭味的重要来源，其在腌制后期的出现或许对鸭蛋品质劣变的预警具有重要意义。

醛类化合物的相对含量在腌制过程中逐渐升高，特别是正丁醛和异戊醛。正丁醛的相对含量在腌制成熟后高达3.79%，通常情况下醛类物质在低浓度下具有草香气息，而在高浓度下带有酸败味、辛辣味。其中己醛是不饱和脂肪酸过氧化物降解的主要产物，具有鱼腥味或杏仁味的苯甲醛来自亚油酸的氧化降解，这些化合物或许来源于咸蛋黄中油脂的氧化降解。

咸蛋清中的挥发性风味物质除了可能来源于咸蛋黄中渗透出的油脂，还可能来源于游离氨基酸的氧化降解。游离氨基酸除了有助于味觉的呈现外，还可以通过Strecker降解有助于挥发性成分的生成，氨基酸与-二羰基化合物反应，失去一分子CO而降解成为少一个碳原子的醛类及氨基酮，形成各种不同的特殊醛类（Strecker醛）。如3-甲基-1-丁醇主要由亮氨酸以及异亮氨酸降解得到，己醛和2-甲基丁醛可以由异亮氨酸氧化降解得到，噻吩等含硫化合物主要由半胱氨酸降解得到以及蛋氨酸可以氧化降解为吡嗪等。

如图3所示，腌制时间0～5 d期间，乙酸乙酯和糠醛相对含量骤升，3-戊酮相对含量骤降，异戊醛开始出现；腌制时间达到10 d时，羟基丙酮相对含量显著升高；腌制时间达到15 d时，异丁酸乙酯显著升高，正己醛、3-甲基-3-丁烯-1-醇相对含量达到最大；丁酸在腌制时间达到20 d时相对含量最高，35 d后反而降低；当腌制时间到达25 d时，同时出现了很多挥发性风味物质，如3-羟基-2-丁酮、2-甲基戊醛、1-辛烯-3-醇、-蒎烯、2-甲基-1-丁醇，有一部分挥发性风味物质相对含量骤升，如四氢呋喃、2-己酮、正丁醛、正丁醇、丙酸，然而醋酸异丙酯在腌制25 d后相对含量反而下降；当腌制时间达到30 d时，很多化合物含量达到峰值，如2-甲基戊醛、1-辛烯-3-醇、-蒎烯、正丁醛、正丁醇、丙酸、乙酸丁酯、1-戊烯-3-酮；正丙醇在腌制时间达到35 d时出现。

表2 海鸭蛋在腌制过程中挥发性物质分析Table 2 Analysis of volatile components in sea duck egg white during salting

续表2

图3 不同腌制时间下咸鸭蛋清VOCs的指纹图谱Fig. 3 Gallery plot of VOCs in sea duck egg white during salting

在腌制过程中，咸蛋清的VOCs发生巨大变化，不同腌制时间标志性挥发化合物也有所不同，根据这些化合物的差异，可以利用GC-IMS区分出不同的腌制阶段，在腌制过程中风味物质的存在与转化也为进一步探究咸鸭蛋的腌制机理提供可参考依据。

2.4 运用多元统计学分析咸蛋清腌制过程中挥发性标志化合物

2.4.1 蛋清腌制过程中挥发性风味物质的PCA

利用指纹图谱很难直观的通过腌制过程中咸蛋清的挥发性成分对腌制过程进行分类，因此采用PCA将具有相似挥发性成分的组别聚集在一起，同时区分开挥发性成分差异大的组别。在化学计量学研究中，这种无监督的方法是建立模型分析数据的基础，因为它只基于样本之间的差异，不需要任何监督信息驱动聚类，对大量、多维的数据进行降维分析，可用于分析样本的归类趋势和异常。

如图4所示，PC1解释了56.3%的方差，PC2解释了14.1%的方差，即这2 个因子可解释原变量70%以上的信息，这2 个PC对分析结果具有一定的代表性。在PC1上0、5、10、15、20 d与25、30、35 d之间的区分度很大，同时在PC2上25、35 d与30 d之间的区分度略大，这与前面的分析结果吻合。腌制25 d后出现很多VOCs，同时化合物的含量也剧增，所以25 d前后风味差异很大；在25～35 d间，很多化合物信号强度呈现先增后减的趋势，并在30 d时达到峰值，所以25 d和35 d的信号强度较为接近，这也是它们与30 d在PC2上有所区分的重要原因。

图4 腌制过程中咸蛋清样品PCA结果Fig. 4 Principal component analysis plot for sea duck egg white during salting

2.4.2 蛋清腌制过程中挥发性风味物质的OPLS-DA

区分不同组别间的特征化合物需要进行OPLS-DA模型的分析，OPLS方法则能够移除变量中与分类变量不相关的变量，使有差异的变量集中在PC1中，模型变得简单和易于解释，通常OPLS-DA是将组别进行两两比较，观察不同组别之间的差异，并采用变量重要性投影（variable importance in project，VIP）值找出区分组别的标志性物质（通常认为是VIP值大于1的物质）。

图5 腌制过程中咸蛋清样品的OPLS-DA模型Fig. 5 OPLS-DA models for sea duck egg white during salting

表3 8 组OPLS-DA模型的得分值Table 3 Scores of OPLS-DA models for eight sea duck egg white samples

通过OPLS-DA模型确定的标志性化合物包括乙酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、正丙醇、异丁酸、醋酸异丙酯、2,3-丁二酮、3-甲基-3-丁烯-1-醇、丙酸、2-甲基丁醛、乙酸丙酯、正丁醛、2-丁酮、异丙醇、异戊醛、异丁酸乙酯、四氢呋喃、2-戊酮、正丁醇、异戊醇与反式-2-戊烯醛。

2.4.3 热图和聚类分析

为了进一步可视化标志性化合物对分类的贡献作用，利用根据OPLS-DA模型获得的特征化合物峰体积进行聚类热图分析，结果见图6。根据咸蛋清腌制过程中筛选出的20 种特征挥发性标志物（VIP＞1），可以将咸蛋的腌制过程分为3 个时期，分别为腌制前（0 d）、腌制中期（5、10、15、20 d）以及腌制后期（25、30、35 d）。在腌制前中期，醋酸异丙酯、2-丁酮表达为正相关，2-甲基丁醛在腌制中期表现正相关，其他大多数标志性化合物都在腌制后期表达为正相关。在腌制到达35 d时，正丙醇和四氢呋喃相关性最高，这2 种化合物或可对产品的劣变起到预警作用。

图6 腌制过程中咸蛋清特征风味物质的热图和聚类分析Fig. 6 Heatmap obtained from cluster analysis of characteristic flavor substances in sea duck egg white during salting

3 结 论

以红泥腌制的海鸭蛋为原料，通过咸蛋清腌制过程中颜色和风味的感官评定分析以及GC-IMS指纹图谱，发现咸蛋清在腌制到25 d时挥发性风味物质骤增，并在30 d时数量和含量都达到峰值。进一步利用PCA和OPLSDA模型将咸蛋清腌制过程中共出现的43 种化合物筛选出20 种特征挥发性化合物，也证明了这些物质在咸蛋清的不同腌制时期确实具有重要代表性。其中异丁酸和丙酸体现不良风味，正丁醛在含量较高时体现酸败味，这几种物质可能是咸蛋清中腥臭味的来源，这些VOCs的前体物质可能是脂肪酸和游离氨基酸，在腌制过程中通过氧化降解和美拉德反应进行积累而形成咸鸭蛋独特的风味。咸蛋清在腌制过程中的变化缓慢、细微，利用GCIMS可以有效区分咸蛋清的腌制阶段，并根据其中的特征物质对产品品质进行判断，为预警产品的劣变提供一定的参考依据和理论基础。