不同等级浓香型大曲微生物群落结构与理化性质的比较分析

向港兴，陈莹琪，沈 毅，王 西，张亚东，罗惠波,3，黄 丹,3,*

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川 自贡 643000；2.四川郎酒股份有限公司，四川 泸州 646000；3.酿酒生物技术及应用重点实验室，四川 自贡 643000）

大曲作为中国白酒酿造过程中物系、酶系及其菌系的重要载体，为白酒发酵过程提供了丰富的微生物类群、功能酶及其风味物质，保证了糖化和发酵作用同时进行。而酒曲的质量是影响白酒风味品质的重要因素，目前行业内对大曲的质量评价还是多依赖于传统感官指标和一些理化指标，且主要依据感官指标；大曲的感官评价包括外观、断面和香味，理化指标则有发酵力、糖化力、液化力、水分、酸度、淀粉含量等，从而将大曲分为多个等级。

近年来，学者针对大曲的质量指标也进行了相关研究，如炊伟强等对泸州老窖大曲感官特征与微生物、理化指标和生化性能进行了关联研究，研究表明优级大曲的液化酶、糖化酶、蛋白酶活力以及水分、酸度均高于普级大曲；且优级大曲的细菌、芽孢杆菌、霉菌、酵母菌和各生化性能也高于普级大曲，但是淀粉含量则低于普级大曲。明红梅等对大曲的传统感官评价指标以及生理生化（糖化力、液化力、发酵力、酯化力、酸度、淀粉、水分）评价指标进行了比较分析，结果发现传统感官质量评价结果和理化指标评价结果均有一定差异。闫宗科等对凤型大曲的感官评定与理化指标及培养工艺进行了分析，结果发现大曲的感官质量与理化指标之间有一定相关性。目前，微生物对大曲质量影响的研究还较少，没有较为深入地研究微生物与大曲质量间的关系。本研究对生产上常用的优级曲和一级曲两种大曲进行分析，利用高通量测序技术比较两种等级大曲的微生物群落结构差异，并对大曲理化指标进行测定，分析其与微生物之间的相关性，以期发现影响大曲质量的微生物因素，为完善大曲评价指标，建立统一的大曲质量评价标准提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

两种等级的大曲样品取自四川泸州某酒厂。各种等级样品随机取3 个样本作为平行样，分别测定大曲理化指标并提取DNA。大曲样品的等级评定从外观、断面和香味3 个方面进行评价（表1）。

表1 优级曲和一级曲感官特征Table 1 Sensory characteristics of superior grade and first grade of Daqu

1.1.2 试剂

氯化钠、邻苯二甲酸氢钾、氢氧化钠、可溶性淀粉、己酸、无水乙醇、葡萄糖（均为分析纯） 成都市科龙化工试剂厂；硫酸、盐酸、冰醋酸（均为分析纯）成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

Vortex-M旋涡混匀仪 上海沪析实业有限公司；电热恒温水浴锅 上海齐欣科学仪器有限公司；智城恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；Illumina MiSeq高通量测序平台 美国Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲质量指标的测定

大曲生化、理化指标的检测参考QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》。

1.3.2 样品总DNA提取

采用Omega.D5625-00土壤DNA提取试剂盒提取样品中的总DNA，提取步骤参考试剂盒说明方法。

1.3.3 PCR扩增

经1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，均满足测序要求，细菌16S rRNA基因引物使用338F/806R（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’/5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），真菌引物使用ITS1F/ITS2R（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’/5’GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）。

扩增程序：95 ℃预变性3 min，27 次循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），然后72 ℃稳定延伸10 min，最后在10 ℃直到反应停止。

细菌扩增体系：4 μL 5×Fast缓冲液，2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.8 μL上游引物（5 μmol/L），0.8 μL下游引物（5 μmol/L），0.4 μL FastDNA聚合酶，0.2 μL牛血清白蛋白，10 ng模板DNA ，ddHO补足至20 μL；真菌扩增体系：2 μL 10×Fast缓冲液，2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.8 μL上游引物（5 μmol/L），0.8 μL下游引物（5 μmol/L），0.2 μL r聚合酶，0.2 μL牛血清白蛋白，10 ng模板DNA，ddHO补足至20 μL。

1.3.4 Illumina MiSeq测序

利用Illumina公司的NovaSeq PE250平台对细菌和真菌序列进行测序分析（上海美吉生物医药科技有限公司），原始数据上传至NCBI SRA数据库。

1.4 数据处理

利用IBM SPSS Statistics 26和Microsoft Office Excel 2010对理化性质进行数据处理及分析；微生物群落结构分析基于美吉生物云平台进行绘制稀释曲线和堆积柱状图等。

2 结果与分析

2.1 不同等级大曲微生物群落结构多样性分析

利用Illumina MiSeq平台对优级曲和一级曲两组曲样的微生物群落进行测序分析，对各样本优化后共得到了1 451 173 条有效细菌序列（平均每个样本有120 931 条细菌序列）和1 453 187 条有效真菌序列（平均每个样本有121 099 条有效真菌序列）。利用各样本在不同测序深度时的微生物Sobs指数构建稀释曲线（图1），随着测序深度的增加，曲线趋于平缓，表明测序量充足，能够覆盖所有样本中的微生物群落。

用标准化的序列进行多样性分析，得到了细菌和真菌的多样性指数见表2。总体来说，优级曲中的物种丰富度和多样性均高于一级曲，且所有大曲中细菌物种的丰富度和多样性普遍高于真菌物种。从这个结果也可得出，大曲中细菌微生物类群比真菌微生物类群更加丰富，并且高质量大曲相比于低质量大曲有更加丰富的微生物区系。

图1 细菌（a）和真菌（b）稀释曲线Fig. 1 Rarefaction curves of bacterial (a) and fungal diversity (b)

表2 不同大曲微生物群落α多样性指数Table 2 α-Diversity indexes of microbial communities in different grades of Daqu

2.2 不同等级大曲微生物群落结构分析

通过Illumina MiSeq测序技术对曲样的细菌和真菌物种进行分析，得到属水平上的物种组成情况。在属水平上，根据平均相对丰度，将样品中相对丰度小于0.01的物种归为一类（others），如图2a所示，优级曲和一级曲两组曲样中优势细菌属为高温放线菌属（）、魏斯氏菌属（）、乳酸杆菌属（）、克罗彭斯特菌属（），这与其他学者的研究结果较为一致。

图2 不同等级大曲细菌（a）和真菌（b）群落在属水平的组成情况Fig. 2 Microbial community composition in different grades of Daqu at the genus level

其中高温放线菌属的相对丰度最高，是样品中的第一优势菌属，在优级曲和一级曲中占比分别为21.17%和30.23%。高温放线菌属是大曲中重要的核心功能细菌微生物，在多种香型白酒酿造大曲中均大量存在，有较强的耐高温特性，能够适应大曲高温的发酵环境，具有产高温淀粉酶、蛋白酶和脱氢酶等能力。魏斯氏菌属在两组大曲中的相对丰度分别为13.48%和12.60%，属于乳酸细菌，能够代谢产乳酸、乙酸等有机酸类物质，有助于乳酸乙酯的生成和酒体风味的形成，是大曲和白酒酿造过程中的主要微生物之一。乳酸杆菌属在两组大曲中占比为11.35%和7.83%，也是白酒酿造过程中的重要功能微生物，具有较强的耐酸性，能够产生乳酸和乳酸乙酯等多种代谢物质，对酒体中酸类和酯类等风味物质的协调有着重要作用；也有研究发现，窖泥中的微生物更倾向于代谢乳酸来产己酸，因此大曲中魏斯氏菌属、乳酸杆菌属等产乳酸的微生物，在进入窖池之后的后期代谢活动可能有利于己酸的生成，对浓香型白酒的主体香味物质己酸乙酯的生成有重要作用。克罗彭斯特菌属是一级曲中第二大优势菌属，相对丰度占比为14.54%，而在优级曲中占比则相对较低低，为4.19%，在刘婷等对不同环境条件下生产的特香性大曲之间的差异研究中，发现克罗彭斯特菌属为其中主要的细菌属；任爱容等研究茅台镇不同主酿区酱香型大曲发现该菌属也为优势菌属，结合研究报道，该菌属在多种香型白酒酿造大曲均为优势菌属，有研究推测其可能与大曲的产香机理有着紧密的联系，但是其在白酒酿造过程中的具体作用报道较少，还有待进一步的研究。其他报道中为优势菌属的芽孢杆菌属（）在两组曲样中占比仅为2.33%和1.17%；葡萄球菌属（）占比为4.58%和2.34%，在两组大曲中占比均不高。芽孢杆菌属是大曲中重要的功能微生物，能够产淀粉酶和蛋白酶等多种酶类，与酯类、吡嗪、芳香族类、有机酸等白酒中重要风味物质的生成有紧密联系，并且有助于减少白酒中的异杂味，以提升白酒的风味品质，在白酒酿造过程中发挥重要作用。葡萄球菌属在自然环境中广泛存在，但是对其在白酒酿造过程中发挥的作用还未明确。在本研究中，两组曲样也检出了一定量的泛菌属（），分别为2.23%和3.12%，有研究表明该菌属在大曲发酵开始阶段只在曲房空气中大量存在，也有研究发现该菌属为酱香型大曲中的优势菌属。而未分类奈瑟球菌科（unclassified_f__Neisseriaceae）在优级曲中占比较高，为3.80%，在一级曲中占比则低于1%，有研究表明其具有产脂肪酸的功能。

由图2b可知，两组大曲中真菌物种种类少于细菌，其中嗜热真菌属（）、未分类曲霉科（unclassified_f__Aspergillaceae）、嗜热子囊菌属（）为两组样品中占比较高的优势物种。在优级曲和一级曲两组曲样中嗜热真菌属相对丰度为34.22%和44.14%，嗜热子囊菌属相对丰度为32.87%和8.42%，嗜热真菌属和嗜热子囊菌属是白酒酿造过程中重要的真菌微生物，已被多次报道在白酒酿造大曲和酒醅中大量存在，该类真菌产生的纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶等酶类具有较高的热稳定性和活力，能够降解代谢原料中的大分子多糖和蛋白质，对白酒酿造过程中微生物的生长繁殖和生香物质的产生有促进作用。霉菌中未分类曲霉科相对丰度分别为20.58%和36.95%，曲霉属（）在优级曲中相对丰度较高为5.37%，一级曲中相对丰度则为1.18%，根霉属（）在优级曲组中相对丰度为1.11%，而在一级曲中则低于1%，霉菌是大曲中重要的功能真菌微生物，能产糖化酶、液化酶、酯化酶等多种酶类，有利于大曲原料的降解发酵，被视作糖化降解动力的主要来源，其生长代谢繁殖情况也在一定程度上反映了大曲的质量特征。在一级曲中、相对丰度高于优级曲，分别为2.50%和1.29%，在优级曲中则低于1%。在本研究中，酵母在两组样品中的相对丰度均很低，除了属于酵母目的、unclassified_p__Ascomycota、，其余如伊萨酵母属（）、假丝酵母属（）、丝孢酵母菌属（）、复膜孢酵母属（），虽然也可以在样品中被检测出，但是其相对丰度均低于1%，酵母菌是白酒酿造过程中产酒产香的主要微生物，但是在浓香型大曲中酵母菌的相对丰度较低，研究表明，在大曲发酵前期由于温度较低，酵母菌大量生长繁殖，随着发酵温度逐渐升高，其他耐热真菌、霉菌开始大量繁殖，酵母菌的生长则受到抑制，优势地位逐渐被取代。

通过对两组大曲在属水平的微生物群落结构比较发现，曲样中优势细菌微生物种类和相对丰度差异不大，其中不同的是一级曲中克罗彭斯特菌属远高于优级曲样品，而优级曲样品中未分类奈瑟球菌科则明显高于一级曲。对于真菌微生物而言，两组大曲中的优势真菌物种没有明显差异，但是不同大曲中优势真菌物种相对丰度有较大差异；在优级曲中嗜热子囊菌属和曲霉属远高于一级曲样品，未分类曲霉科则是一级曲高于优级曲。由此可以看出，两种等级的大曲中优势微生物物种一致，但是相对丰度有着一定差异，细菌优势微生物中克罗彭斯特菌属和真菌优势微生物中的嗜热子囊菌属和霉菌均有较大的差异，这可能也是导致大曲质量存在差异的原因。

2.3 不同等级大曲差异微生物分析

为了进一步分析不同等级大曲微生物的差异，利用LEfSe分析解析两组大曲中的差异微生物，并结合Wilcoxon秩和检验对两组样品的差异微生物的相对丰度进行评估，获得优级曲和一级曲中具有显著差异的物种，两组大曲中细菌差异微生物结果如图3所示。

图3 细菌LEfSe多级物种层级树图（a）、LDA柱形图（b）和两组比较秩和检验条形图（c）Fig. 3 Bacterial LEfSe multi-level species hierarchical tree diagram (a),LDA histogram (b), and bar graph of rank sum test between two groups (c)

从图3a、b可以看出，在属水平两组大曲中共检测出9 种差异微生物，线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）值＞3，其中优级曲中差异物种为泰氏菌属（）、肠球菌属（）、乳球菌属（）、、嗜蛋白菌属（）、红球菌属（）、变形杆菌属（），一级曲中差异微生物为沙雷氏菌属（）、g__unclassified_c__Alphaproteobacteria。且优级曲的红球菌属、变形杆菌属、乳球菌属、嗜蛋白菌属、肠球菌属的相对丰度显著高于一级曲（＜0.05）（图3c）。一级曲中的沙雷氏菌属极显著高于优级曲（＜0.01），虽然其并未在白酒酿造中体现出功能，但有可能通过微生物的相互作用影响大曲微生物菌群结构；g__unclassified_c__Alphaproteobacteria菌属显著高于优级曲。两组大曲差异细菌微生物中乳球菌属虽然相对丰度低于1%，但是具有水解蛋白和产生特征风味物质的能力，被广泛应用于发酵乳制品中（干酪、酸奶、酸奶油），虽然在白酒酿造过程中的研究报道较少，但是其产酯、酸、酮等风味物质的能力在白酒酿造过程中发挥的作用也值得关注。

图4为两组曲样中真菌物种LEfSe分析和差异显著性检验结果，可知在属水平上，两组大曲中检测出差异物种共有9 种（LDA＞3）。其中优级曲差异微生物为嗜热子囊菌属（）、g__unclassified_p__Ascomycota、根霉属（）、假丝酵母属（）、；一级曲中的差异微生物为耐干霉菌属（）、、、未分类曲霉科（g__unclassified_f__Aspergillaceae）。优级曲中的嗜热子囊菌属、g__unclassified_p__Ascomycota、根霉属、假丝酵母属、相对丰度均显著高于一级曲，而一级曲中的耐干霉菌属、未分类曲霉科的相对丰度显著高于优级曲。

图4 真菌LEfSe多级物种层级树图（a）、LDA柱形图（b）和两组比较秩和检验条形图（c）Fig. 4 Fungal LEfSe multi-level species hierarchical tree diagram (a),LDA histogram (b), and bar graph of rank sum test between two groups (c)

两组大曲中的差异微生物分析结果表明，细菌差异微生物均是样品中相对丰度较低的一类物种，除了乳球菌属，其他微生物在白酒酿造过程中的功能暂未见报道；而真菌差异微生物不同的是，其中嗜热子囊菌属、未分类曲霉科是样品中的优势真菌物种，且大部分差异真菌微生物均在白酒酿造过程中发挥重要的作用，如嗜热子囊菌属、未分类曲霉科、根霉属、假丝酵母属等。因此可以推测，正是这些真菌微生物，特别是嗜热子囊菌属、未分类曲霉科在制曲过程中大量生长繁殖，并产生各种代谢产物，最终导致了大曲质量之间的差异。

2.4 不同等级大曲理化、生化指标的差异

大曲理化指标如水分、酸度等在一定程度上能够很好地反映出大曲的质量，也是目前大曲质量评价的重要指标，生化指标则反映大曲中酶系的功能组成以及微生物的生长繁殖情况。利用SPSS软件采用单因素方差分析，比较两种等级大曲的理化指标差异，分析结果见表3。

表3 不同大曲样理化性质Table 3 Physicochemical properties of different grades of Daqu

从表3可以看出，两组曲样的水分、总酸含量、pH值均有显著差异，大曲中水分含量主要受到曲房温度、湿度以及微生物生长特别是丝状微生物的影响，而较低水分含量不利于微生物的生长代谢活动，两组大曲的水分均低于13%，其中优级曲水分显著低于一级曲；总酸含量是微生物生长过程中代谢产酸以及脂肪、淀粉和蛋白质降解生成酸类物质的总和，能够在一定程度上表征大曲发酵过程中微生物的生长代谢情况，优级曲的总酸含量显著高于一级曲，pH值则显著低于一级曲，且两组总酸含量均在0.9～1.3 mmol/10 g之间，达到了一级曲质量标准。糖化力和液化力大小反映了大曲中糖化酶和液化酶的酶活力大小，其主要由霉菌和芽孢杆菌产生，有研究表明丝状真菌能够提高大曲的糖化力，其中优级曲液化力大小、糖化力大小均显著低于一级曲（＜0.05）。酯化力反映了大曲中酯化酶催化酸类和醇类物质生成酯类化合物能力的大小，发酵力则是体现了大曲中微生物发酵产酒的能力，也在一定程度上反映了微生物的生长代谢情况。可知，优级曲的酯化力显著高于一级曲样品，发酵力也大于一级曲，但是没有显著差异。

2.5 大曲理化指标与微生物的相关性分析

为了进一步解析大曲理化指标与微生物之间的关系，利用冗余分析（redundancy analysis，RDA）两者之间的相关性。由于很多理化因子之间存在着较强的共线性关系，因此首先通过方差膨胀因子（variance inflation factor，VIF）分析，筛选去除共线性较强（VIF＞10）的理化因子，最终保留了酸度、pH值和发酵力作为重要理化变量用于后续的RDA。

图5 细菌（a）、真菌（b）与理化指标的RDAFig. 5 Redundancy analysis of bacteria (a) and fungi (b) versus physicochemical indicators

图5展示了大曲微生物中相对丰度前10的细菌和真菌物种与大曲理化指标之间的关系。细菌中的魏斯氏菌属、乳酸杆菌属、葡萄球菌属和真菌中的嗜热子囊菌属与pH值和发酵力呈正相关，魏斯氏菌属、乳酸杆菌属等这类产酸微生物在大曲中大量存在，可能也是导致优级曲pH值显著低于一级曲的原因，而高温放线菌属、克罗彭斯特菌属与pH值呈负相关，可能的原因是这两类微生物都属于放线菌，更适应于在中性或微碱性的环境中生存，因此在一级曲中这两类微生物的相对丰度均远高于优级曲；而对大曲发酵力而言，由于不管是酵母菌的乙醇发酵还是细菌乙醇发酵，乙醇的产生都是通过丙酮酸脱羧成乙醛后被还原为乙醇，即乙醇和CO具有伴生关系，因此大曲发酵力是以大曲中微生物产CO的量表征。但是，在发酵力测定条件下，大曲微生物仍然存在有氧呼吸，即微生物存在三羧酸循环代谢途径，该过程尽管没有乙醇的合成，但却存在CO生成。同时，异性乳酸或同型乳酸发酵条件下也会有CO的生成。因此分析结果显示这几类微生物与发酵力呈正相关，并不意味这几类微生物与乙醇的合成呈正相关。

3 结 论

对优级曲和一级曲两种等级大曲的微生物群落结构与理化指标进行了比较分析，并结合数理分析法研究了微生物与理化指标之间的关系。通过对两种等级大曲的微生物群落结构进行分析，结果表明两种大曲的优势物种基本一致，但是物种间的相对丰度有较大差异；经LEfSe分析并结合Wilcoxon秩和检验，结果发现两种等级的大曲之间的细菌差异微生物均为样品中的低丰度物种，而真菌差异微生物中的、未分类曲霉科为大曲中优势物种，且相对丰度具有显著差异；理化分析结果表明，两种等级的大曲理化性质除了发酵力外均有显著差异，结合RDA发现乳酸杆菌属、魏斯氏菌属、葡萄球菌属、嗜热子囊菌属、曲霉属与总酸含量和发酵力呈正相关。这些结果说明了不同等级大曲的优势微生物相对丰度存在较大差异，且理化指标之间也存在显著差异，特别是嗜热子囊菌属和未分类曲霉科在两种等级大曲中的相对丰度差异显著，与大曲的理化性质息息相关，而大曲中这些优势真菌微生物的显著差异可能就是影响大曲质量的重要微生物因素。前述结论表述了对大曲质量有重要影响的微生物类群，为进一步完善大曲评价指标，建立浓香型大曲质量评价标准提供了理论参考。