改性处理对大豆分离蛋白/壳聚糖/黑木耳多糖复合膜性质的影响

孙海涛，赵婉竹，赵兵兵，邵信儒，钟子杰，石金风，姜瑞平，刘 鹏

（1.通化师范学院 长白山食用植物资源开发工程中心，吉林 通化 134000；2.通化师范学院食品科学与工程学院，吉林 通化 134000）

近年，环境保护越来越受到人们的重视，以天然高分子材料为基材的可食膜因具有无毒害、可降解以及特殊的功能特性引起人们的关注。

蛋白质、多糖具有良好的成膜特性被广泛用作成膜基材，采用共混、层合等方式制备生物复合膜。Muley等对比了壳聚糖（chitosan，CS）/乳清蛋白复合膜与CS膜、乳清蛋白膜物理性质的差异，发现CS/乳清蛋白复合膜的抗拉强度（tensile strength，TS）显著高于CS膜和乳清蛋白膜，断裂伸长率（elongation at break，EAB）无显著差异。Jia Dongying等研究证明甘油是制备大豆蛋白/葡甘露聚糖/CS复合膜的合适増塑剂。Zhang Lifen等研究了大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）/CS共混涂膜对杏果实性质的影响，表明SPI/CS共混涂膜可有效降低杏果实质量损失率，延长果实软化时间，对可滴定酸度、可溶性固形物和果胶的保持等发挥有益的作用。

此前研究发现，蛋白质/多糖复合膜在机械性能和阻隔性能等方面仍存在不足，影响了其在食品包装与保鲜中的广泛应用。为进一步提高生物复合膜的性能，利用物理方法和化学方法改性处理膜液或膜材成为有效的手段。超声波作用产生振动并传递高能量，可增强目标分子间的质量传递和相互作用力。Vera等考察了高强度超声与转谷氨酰胺酶协同改性对藜麦蛋白/CS复合膜性质的影响，发现在超声辅助作用下，转谷氨酰胺酶与蛋白质、CS分子相互作用产生交联，形成共价键，使复合膜厚度增加，TS增大，EAB降低，热稳定性提高。微波改性处理使目标极性分子产生高速运动，破坏大分子氢键并增强分子间的交联作用。Gan等对比了微波固化与常规加热方式对CS/纤维素纳米晶共混膜性能的影响，证实了通过微波固化处理使复合膜发生交联，膜的阻湿性增强、降解率下降。Wang Zhe等研究了超声波/微波联合作用对大豆蛋白/油酸复合膜水蒸气透过率和接触角的影响，结果表明在超声波/微波功率500 W、温度20 ℃、时间15 min的条件下，膜具有最低的水蒸气透过系数（water vapour permeability，WVP）（0.1×10g/（cm·s·Pa））和最高的接触角值（135°），充分发挥了超声波、微波各自的优势。López等通过紫外光对聚四氟乙烯薄膜进行改性处理，对薄膜的表面疏水特性有显著的影响，为其在生物复合可食膜中的应用提供了借鉴。超声波、微波、紫外光作为重要的物理处理方法，在膜的制备和改性领域显示出良好的优越性。

黑木耳多糖（Auricularia auricular polysaccharide，AAP）作为一种天然多糖，与SPI、CS共混制备复合膜，不仅可有效利用AAP溶解性强、感官质量好等优点，亦可发挥AAP抗氧化、抗炎、抗凝血和增强免疫力等作用，赋予复合膜一定的功能特性。进一步通过超声波、微波、紫外光及其协同改性处理制备SPI/CS/AAP复合膜（SPI/CS/AAP），对复合膜进行性质研究和结构表征，以期为提高可食膜的综合性能和促进新型食品包装的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPI（食品级，粗蛋白≥90%） 安阳天祥瑞食品科技有限公司；CS（分析纯，脱乙酰度80%～95%） 国药集团化学试剂有限公司；AAP（纯度≥50%）由实验室自制；丙三醇（分析纯） 天津永大化学试剂有限公司；冰乙酸（分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SL-SM50型超声微波组合反应系统 南京顺流仪器有限公司；IS50型傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪 美国尼高力仪器公司；CT3型质构仪 美国博勒飞公司；S-3000N型扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM） 日本日立公司；TG-DTA-LR型综合热分析仪上海众路实业有限公司；UV-2600紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；AL104型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FJ200-S型数显高速分散均质机 上海标本模型厂；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；DZX-9140MBE型电热恒温鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司；SPX-250型恒温恒湿培养箱 常州诺基仪器有限公司；螺旋测微尺 深圳市新德亚精密仪器有限公司；有机玻璃成膜器（200 mm×200 mm）由实验室自制。

1.3 方法

1.3.1 改性SPI/CS/AAP膜的制备

按照文献[17]的方法提取、分离纯化AAP，得到AAP粉末。称取3 g SPI和1 g AAP分别按料液比1∶20（g/mL）溶解于蒸馏水中，备用；称取1 g CS按料液比1∶20（g/mL）溶解于1%的乙酸溶液中，备用。将上述材料混合，加入1.3 g丙三醇，50 ℃恒温磁力搅拌30 min，然后在10 000 r/min均质10 min，使膜液混合均匀，分别进行超声波、微波、紫外光改性处理，真空消泡后倒入有机玻璃成膜器中，经55 ℃、6～8 h干燥处理后揭膜，得到改性SPI/CS/AAP膜，最后置于25 ℃、相对湿度60%的恒温恒湿箱中平衡24 h，待测。以未经改性处理的SPI/CS/AAP膜作为对照，样品编码及改性处理条件见表1。

表1 复合膜样品编号及改性处理条件Table 1 Coding and modification treatment conditions of the composite film

1.3.2 复合膜的性能测试

1.3.2.1 厚度

使用螺旋测微尺精确测量膜样品四角和中心点5 个点的厚度，取平均值。

1.3.2.2 机械性能

将膜裁剪成70 mm×20 mm的长方形，用质构仪进行测试。按照GB/T 1040.3—2006《塑料拉伸性能的测定第3部分：薄膜和薄片的试验条件》进行测试，TS和EAB分别按式（1）、（2）计算：

式中：F为膜发生断裂时所承受的最大张力/N；B为膜宽度/mm；H为膜厚度/mm；D为膜断裂时总长度/mm；L为膜初始长度/mm。

1.3.2.3 阻隔性能

WVP测定：参照GB/T 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸气性试验方法 杯式法》进行测试。将盛有蒸馏水的测试杯置于干燥器中，测量膜在一定时间内的水蒸气透过量，根据式（3）计算WVP：

式中：WVP为水蒸气透过系数/（g/（cm·s·Pa））；Δm为t时间内透湿杯的质量变化/g；S为试样透过蒸汽的面积/cm；t为称量间隔时间/s；H为试样厚度/cm；ΔP为膜两侧的水蒸气压差/Pa。

氧气透过率（oxygen permeability，OP）测定：参照GB/T 1038—2000《塑料薄膜和薄片气体透过性试验方法 压差法》和文献[18]的方法并加以改进，测量膜在一定时间内的氧气透过量，根据式（4）计算OP：

式中：Δm为测试杯的质量变化/g；D为称量间隔时间/d；S为试样透过氧气的面积/m。

1.3.2.4 表面色度

利用表面色度仪测试膜的色度。表面色度仪校正后，将膜样品平放于白色校正背景板（L*＝94.10，a*＝-1.39，b*＝-0.91）上方进行测试，测试孔直径8 mm，根据式（5）计算总色差（ΔE）：

式中：ΔE为总色差；L为膜的亮度；a为膜的红/绿；b为膜的黄/蓝；L*为校正背景的亮度；a*为校正背景的红/绿；b*为校正背景的黄/蓝。

1.3.2.5 透光性能

将膜裁成30 mm×10 mm的长方形，置于比色皿的内侧，利用紫外-可见分光光度计在波长200～800 nm范围内进行测试，得到膜的透光率曲线。

1.3.3 复合膜的结构表征

1.3.3.1 SEM测定

将膜裁成5 mm×5 mm和5 mm×1 mm的方形，分别喷金后观察膜表面（×5 000）及横截面（×1 000）形态，加速电压为20 kV。

1.3.3.2 FTIR测定

采用衰减全反射光谱方法，将膜样品平放于测试台上，调整测试探头紧贴样品。测试参数：分辨率4 cm，扫描范围4 000～550 cm，扫描次数16 次。

1.3.3.3 热重（thermogravimetric，TG）和差示量热扫描（differential scanning calorimetric，DSC）

取10 mg剪碎的膜样品置于坩埚内，以空坩埚做对照，用综合热分析仪进行测试。TG测试参数：测试温度范围30～500 ℃，升温速率30 ℃/min。DSC测试参数：测试温度范围40～200 ℃，升温速率10 ℃/min；记录TG和DSC曲线。

1.4 数据统计与分析

每个膜的性质测试重复3 次，取平均值，采用SPSS 19.0软件进行数据分析，显著水平（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 复合膜的性能分析

2.1.1 机械性能分析

由图1可知，SPI/CS/AAP（对照）膜的TS和EAB均为最小值（14.85 MPa，55.12%），超声波、微波、紫外光改性处理可显著改善膜的机械性能，其中UM-SPI/CS/AAP膜的TS达到最大值21.67 MPa，UMUV-SPI/CS/AAP膜的EAB达到最大值78.02%。这是由于超声波微波协同作用可产生高频振荡和空化效应，降低成膜基质微粒尺寸，增大分子间重排和接触几率，造成分子间的剧烈碰撞，增强分子间的作用力，形成致密的网络结构。另外，超声波、微波和紫外光辐射协同处理可以提高成膜基质的相容性，经处理后使基质分子质量降低，膜的胶凝特性和韧性增强，EAB增大。超声波、微波、紫外光同时改性处理对膜的增容效果不佳，会引起复合膜聚合物的缺口抗拉强度降低，因此，UMUV-SPI/CS/AAP膜的TS显著低于UM-SPI/CS/AAP膜。

图1 复合膜的TS和EABFig. 1 TS and EAB of the composite film

2.1.2 阻隔性能分析

由图2可知，SPI/CS/AAP（对照）膜的WVP和OP均为最大值（2.49×10g/（cm·s·Pa）、0.79×10g/（m·d）），超声波、微波和紫外光改性处理对膜阻隔性能都有显著改善作用。经过超声波微波协同改性处理的UM-SPI/CS/AAP膜具有最佳的阻隔性能，WVP和OP均达到最小值（1.34×10g/（cm·s·Pa）、0.47×10g/（m·d））。这是由于在超声波微波协同作用下，产生超混合效应和热效应，使成膜基质蛋白质中的氨基与多糖中的羰基之间发生反应并充分交联，形成蛋白质-多糖共价复合物，提高了复合膜的疏水性及其氧气的屏障作用，WVP和OP降低。Cheng Wenjian等利用超声波处理淀粉基可食膜，有效降低了膜的WVP值，观察到与本研究同样的结果。单一的超声波、微波、紫外光改性处理和3 种方法协同改性处理同样可以增强膜的阻隔性能，但效果不如超声波微波协同改性处理。Mozafarpour等证实了高强度超声联合转谷氨酰胺酶改性作用可增强藜麦蛋白/CS复合膜的阻湿性能；赵扬等研究表明，通过微波改性SPI可食膜，可使SPI分子变性，有效阻止氧分子透过，进而显著降低SPI可食膜的透氧系数，进一步证实本研究结果。

图2 复合膜的WVP和OPFig. 2 WVP and OP of the composite film

2.1.3 表面色度分析

如表2所示，与对照膜相比，经过超声波、微波、紫外光改性处理的复合膜的表面色度各参数（L值、a值、b值、ΔE值）发生显著变化。UM-SPI/CS/AAP膜和UMUV-SPI/CS/AAP膜的L值最大，显著高于SPI/CS/AAP（对照）膜，这是由于经过超声波、微波和紫外光处理，使膜液中各组分产生交联，各基质分子之间的相互作用增强，成膜更加均匀、致密，复合膜的亮度和透明度增大。SPI/CS/AAP（对照）膜的a值和b值分别为最大值3.13和19.24，与经过改性处理的复合膜相比，膜的颜色更深，偏红、黄；UM-SPI/CS/AAP膜的a值和b值分别为最低的1.380 0和12.586 7，说明经过超声波微波协同改性处理使膜的洁白度增加。从ΔE值分析可知，U-SPI/CS/AAP、M-SPI/CS/AAP、UM-SPI/CS/AAP、UV-SPI/CS/AAP、UMUV-SPI/CS/AAP膜的ΔE值与SPI/CS/AAP（对照）膜的ΔE值相比存在显著差异，表明超声波、微波和紫外光改性处理对膜的总色差具有显著影响，改善了复合膜的表面色度。

表2 复合膜的表面色度Table 2 Color parameters of the composite film

2.1.4 透光性能分析

食品包装薄膜不仅应阻隔紫外线，而且还应具有一定的透明度。如图3所示，在波长200～390 nm范围内，复合膜的紫外光透过率都较低，这是由于SPI和CS对紫外光具有一定的吸收性，均显示出较好的紫外光阻隔能力。在波长390～800 nm范围内，SPI/CS/AAP（对照）膜的可见光透过率最低；随着波长的不断增大，所有膜的透光率逐渐增大，当波长超过600 nm时，UMSPI/CS/AAP膜的透光率最高，具有更好的包装外观和透明度。这是由于超声波产生的空化和超混合作用破坏了膜基质中蛋白质和多糖等大分子的化学键，分子粒径减小；微波处理进一步促进了分子移动和重新排列，提高了各成膜基质的相容性，膜的可见光透过率增强。该结果与膜的表面色度研究结果相符。

图3 复合膜的紫外-可见光透光率Fig. 3 UV-vis light transmittance of the composite film

2.2 复合膜的结构表征

2.2.1 SEM分析

图4 复合膜的SEM图Fig. 4 SEM images of the composite film

由图4A～A可知，所有膜的表面均比较光滑、均匀和致密，无孔隙和裂缝。但与经过改性处理的膜相比，SPI/CS/AAP膜表面存在颗粒和团聚现象，这是由于成膜基质溶解不彻底、分散不均匀所致，超声波、微波、紫外光改性处理可促进各聚合物基质在膜液中更好地分散，提高各基质之间的相容性。由图4B～B可知，SPI/CS/AAP膜的横截面出现分层和断裂现象，而经过超声波、微波、紫外光改性处理的复合膜横截面结构紧凑，形成较致密的网络结构，这是由于经过超声波、微波、紫外光改性促进了分子间氢键的形成，增强了膜基质分子之间的交联作用。与其他膜截面相比，UMSPI/CS/AAP膜（图4A、B）展现出更光滑、均匀的平面结构和致密、连续的横截面网络结构，这进一步说明超声波微波协同改性对成膜体系具有良好的调节作用，该结果与Wang Zhe等研究的超声波-微波改性处理对SPI-油酸复合膜的影响具有相似的趋势。

2.2.2 FTIR分析

由图5可知，所有膜在3 800～3 000 cm范围内出现宽吸收带，这是由于O—H和N—H基团的伸缩振动；2 922 cm处出现C—H伸缩振动峰，这与膜分子间的氢键作用相关；在1 632、1 150 cm附近出现2 个吸收带，分别对应于酰胺I带的—C＝O伸缩振动和酰胺Ⅲ带的N—H的弯曲振动，所有复合膜的酰胺I带和酰胺III带的吸收峰位置几乎保持不变，表明蛋白质链和极性基团之间由于分子间氢键作用而形成稳定的结构，这与Castao等研究多糖-蛋白质复合膜的FTIR结果相似。UM-SPI/CS/AAP膜在1 540 cm处出现明显的吸收峰，对应于酰胺II带—C＝O和C—N伸缩振动，这是由于经过超声波微波协同作用产生的空化效应和高频振动使蛋白质发生结构性振荡。在1 050 cm和670 cm附近出现的吸收峰为SPI的特征峰，分别对应于C—C骨架的伸缩振动和C—O的伸缩振动，说明超声波、微波、紫外光改性不会完全破坏SPI的二级结构，仍具有SPI的典型特征，也可反映出SPI分子中的反应性侧基很好地参与成膜交联反应。

图5 复合膜的FTIR光谱Fig. 5 FTIR spectra of the composite film

2.2.3 TG和DSC分析

图6 复合膜的TG和DSC曲线Fig. 6 TG and DSC curves of the composite film

由图6a可知，在温度升高至100 ℃的初始阶段，SPI/CS/AAP（对照）、U-SPI/CS/AAP、M-SPI/CS/AAP、UM-SPI/CS/AAP、UV-SPI/CS/AAP、UMUV-SPI/CS/AAP膜的质量损失分别为7.27%、7.81%、3.43%、1.02%、1.28%和1.89%，这主要是由于膜中水分脱附蒸发。当温度继续升高至200 ℃时，TG曲线变陡，这主要是由于甘油的挥发和CS分子氨基的裂解。TG曲线亦可以观察到UM-SPI/CS/AAP、UMUV-SPI/CS/AAP膜的降解速率低于其他复合膜，稳定性更好；经500 ℃热处理的膜样品残余率分别为24.71%、28.13%、26.35%、36.64%、39.20%和25.47%，其中UM-SPI/CS/AAP和UVSPI/CS/AAP膜的残余率最大，SPI/CS/AAP（对照）的残余率最低，进一步证明经过超声波微波协同改性和紫外光改性处理后的复合膜热稳定性提高，SPI、CS和AAP分子间的相互作用加强。

由图6b可以观察到SPI/CS/AAP（对照）、U-SPI/CS/AAP、M-SPI/CS/AAP、UM-SPI/CS/AAP、UV-SPI/CS/AAP、UMUV-SPI/CS/AAP膜无定形化合物的玻璃化转变温度约为55 ℃，对应的焓值分别为8.98、22.52、14.28、25.96、10.02 J/g和23.39 J/g，经超声波、微波、紫外光协同改性处理的复合膜具有更高的焓值说明无定形聚合物的状态从弹性状态转变为玻璃状态时，聚合物链需要更高的键能才能使分子链断裂。同时可以观察到，UM-SPI/CS/AAP和UMUVSPI/CS/AAP膜的熔融温度明显高于其他复合膜，这是由于超声波、微波和紫外光协同改性处理增强了SPI、CS和AAP分子链之间的交联作用，降低了成膜基质的分子流动性，使其在更高的温度下出现吸热峰，膜热稳定性提高。

3 结 论

采用超声波、微波、紫外光及其协同改性技术制备SPI/CS/AAP复合膜，改善复合膜的性质。结果表明，超声波微波协同改性处理效果最佳，可显著改善膜的机械性能、阻隔性能、光学性能和热稳定性。SEM结果表明，经超声波微波协同改性处理制备的复合膜，展现出更光滑均匀、致密连续的膜结构；FTIR和TGA研究结果进一步证明，超声波微波协同改性对成膜体系具有良好的调节作用，膜基质间相容性好，各组分分子间产生了较强的相互作用。研究结果可为新型生物复合可食膜的开发和进一步应用提供参考。