单基因自身炎症性疾病的动物模型

黄欣，沈敏

自身炎症性疾病(systemic autoinflammatory diseases，SAIDs)是由于基因突变引起固有免疫异常，进而造成系统性或器官特异性炎症的一组遗传性疾病。本组疾病按照遗传特征分为单基因SAIDs和多基因多因素SAIDs。其中单基因SAIDs包括家族性地中海热(familial Mediterranean fever，FMF)、NLRP3相关自身炎症性疾病(3-associated autoinflammatory disease)、肿瘤坏死因子受体相关周期性综合征(tumor necrosis factor receptor-associated periodic syndrome，TRAPS)、腺苷脱氨酶2缺乏症(deficiency of adenosine deaminase 2，DADA2)、婴儿起病的STING相关血管病[stimulator of interferon genes (STING)-associated vasculopathy with onset in infancy，SAVI]、A20单倍体剂量不足(haploinsufficiency of A20，HA20)等罕见病。从该病20世纪末被命名以来的20年，随着基因测序技术的提高，许多新的单基因SAIDs致病基因不断被发现，对该病的认识也在不断加深，发现固有免疫失调在SAIDs的发病中起到了重要作用，但是SAIDs的发病机制仍然尚未阐释清楚，治疗也缺乏有效手段。

实验动物是进行人类疾病研究的重要载体。主要的实验动物有酵母菌、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠、猪等，其中小鼠在医学研究中应用最广泛。动物模型能够模拟人类疾病的临床表现，可以帮助认识疾病的发生、发展及病理生理机制，还可为药物治疗靶点提供证据。SAIDs发病率低，多与遗传相关联，难以建立自发动物模型和诱发动物模型。基因工程动物模型可以通过转基因、基因打靶等基因工程技术实现遗传信息的转移，使实验动物出现单基因SAIDs的表型。基因工程动物模型的构建技术随着时代的进步而发展，从开始的转基因技术、基因打靶技术，到转座子介导的基因转座、体细胞核移植技术等，再到近年来飞速发展的基因编辑技术，科学家们目前已经可以实现精准构建基因修饰动物模型。构建基因编辑小鼠最常用的方法主要有锌指核酸内切酶(zincfingerendonucleases，ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionalactivatoreffectornucleases，TALEN)和CRISPR-Cas9等技术。构建SAIDs基因修饰小鼠模型的目的是为了更好地了解SAIDs这类疾病，更应该关注小鼠模型的适用性，而不是技术的优劣性。本文主要综述基因工程小鼠在单基因SAIDs中的应用，包括其在发病机制、病理生理以及治疗方面的研究，并展望应用前景。

1 已报道的单基因SAIDs动物模型

1.1 FMF动物模型

FMF是最常见的单基因SAIDs，主要特点是周期性发作的发热，伴浆膜炎、滑膜炎或皮炎，部分患者最终发展为系统性AA型淀粉样变。FMF的致病基因为位于16号染色体的，其编码的蛋白质炎素(pyrin)可以作为一种先天性免疫传感器触发半胱氨酸蛋白酶- 1(Caspase- 1)的激活以及白细胞介素(IL)- 1β、IL- 18的产生。常见的致病性突变有M680I，M694V，M694I和V726A(https：//infevers.umai-montpellier.fr/web/)。小鼠、大鼠及斑马鱼均有与人类同源的基因。小鼠与人类的同源基因同样位于16号染色体且构建技术较为成熟，多种基因工程小鼠被用于探究FMF的发病机制及病理生理(http：//www.informatics.jax.org/)。大多数的FMF突变聚集在炎素的C端B30.2域，具有人类B30.2域的纯合敲入小鼠、和表现出与FMF相似的严重自发性炎症，包括关节炎和皮炎。其中小鼠炎症表型最严重，出生1周左右即出现皮肤鳞片状皮炎，2- 3周死亡。而和出现发育迟缓、消耗症状、皮炎和关节炎等表现。这些基因工程小鼠是应用广泛的FMF疾病模型。

1.2 NLRP3-AID动物模型

3-AID又称冷炎素相关周期性综合征(cryopyrin associated periodic syndromes，CAPS)，主要表现为周期性发热伴皮疹(荨麻疹最常见)和中枢神经系统炎症。根据患者临床表现自轻到重可分三种疾病：家族性冷自身炎症综合征(familial cold autoinflammatory syndrome，FCAS)、Muckle-Wells综合征(Muckle-Wells syndrome，MWS)和慢性婴儿神经皮肤关节综合征(chronic infantile neurological cutaneous articular syndrome，CINCA)。FCAS在寒冷暴露后出现寒战、发热、头痛、关节痛、结膜炎和荨麻疹样皮疹。MWS与寒冷暴露关系不密切，也会有发热、荨麻疹样皮疹、关节痛/炎、结膜炎，还可出现慢性无菌性脑膜炎、感音神经性聋。而CINCA是最重的类型，一般自出生起持续终生，前述发热、皮疹、关节炎等症状更严重，并有严重的中枢神经系统炎症表现。3-AID的致病基因是3，常见致病性突变主要位于外显子3，包括R260W、D303N、T348M和A352V等(https：//infevers.umai-montpellier.fr/web/)，通过构建携带相应突变的小鼠模型可以验证这些突变的致病性。FCAS小鼠模型携带L351P突变，MWS小鼠模型则携带A350V突变，这两种小鼠都表现出生长发育异常，并出现全身炎症反应。另一种携带R258W突变的MWS小鼠则主要表现为自发性皮肤炎症。CINCA小鼠有两种，一种是3，另一种是3，后者表现出淀粉样变。其他类型的3-AID小鼠生长迟滞且死亡较早，但CINCA小鼠的存活时间延长，可能是其能被观察到淀粉样变的原因。值得一提的是，3-AID小鼠模型的表型与人类疾病表型严重程度相反，人类疾病中表型最严重的CINCA，与之相应基因突变的小鼠却呈现出最轻的表型，这显示出小鼠模型的局限性。

1.3 其他单基因SAIDs动物模型

TRAPS也是一种常见的单基因SAIDs，是由基因突变引起的常染色体显性遗传性疾病，主要临床表现为反复发热，除了与FMF相似的腹痛、胸痛和滑膜炎之外，TRAPS还常出现眼炎(最常见结膜炎和眶周水肿)，以及特征性游走性肌痛，伴或不伴表面痛性红斑。TRAPS敲入小鼠模型分别携带外显子2上的C33Y突变以及外显子3上的T50M突变，这两个突变均是infever网站(https：//infevers.umai-montpellier.fr/web/)中的致病性突变。有学者还曾构建了TNF受体缺陷的小鼠证明p55和p75在介导和调节体内TNF活性中的作用。

SAVI是一种自婴儿期起病，主要以血管病变为特征的罕见的常染色体显性遗传性疾病，其致病基因为，编码蛋白STING。研究者们构建了敲入N153S突变的SAVI小鼠模型，表现为自发性肺部炎症、皮肤溃疡以及寿命缩短等症状。另一种敲入V154M突变的SAVI小鼠模型则表现出联合免疫缺陷表型、低丙种球蛋白血症以及不同程度的肺部炎症和肾脏炎症(表1)。

表1 单基因SAIDs小鼠模型

2 动物模型在单基因SAIDs的应用

利用上述动物模型，可以对单基因SAIDs的遗传、发病机制和治疗开展深入研究。

2.1 遗传机制研究

2.1.1 遗传方式研究：FMF长期以来一直被认为是一种常染色体隐性遗传疾病，杂合敲入小鼠表型正常，而纯合敲入小鼠表现出FMF的炎症表型，由此能够验证FMF的隐性遗传模式。但是，有些FMF的患者只携带一个致病基因并表现出常染色体显性遗传的特征，有学者猜测这或许是疾病的不完全外显以及可变表现度所致。3-AID和SAVI的遗传方式都呈现常染色体显性遗传，研究发现携带上述基因致病突变的杂合小鼠即可表现出相应疾病的炎症表型，与常染色体显性遗传的遗传方式相一致，因此确定了这些疾病的遗传方式。小鼠模型还可以被用来探讨外显率及表现度差异的影响因素。

2.1.2 编码蛋白功能研究：插入FMF相关突变B30.2域可以使小鼠产生炎症，而被靶向破坏基因的小鼠却并未表现出FMF相关炎症表型，说明FMF符合功能获得性突变基因致病。杂合敲入小鼠，和生长正常，也无炎症表现，而纯合敲入小鼠则发病，这说明FMF符合隐性遗传模式。研究者构建了半合子小鼠726-，这种小鼠只携带一个来自致病基因的突变，但是却并不存在炎症表型。由此可见，小鼠模型能帮助我们认识到FMF发病机制中基因功能获得性突变以及基因剂量效应的现象。

敲入3L351P突变以及A350V突变的小鼠都表现出了与人类3-AID相似的炎症表型，提示这两种突变是功能获得性突变。与野生型小鼠相比，3 D301N突变小鼠也表现出全身炎症以及生长迟缓，表明D301N也属于功能获得性突变。因此，通过小鼠模型可以证实3-AID是由于3功能获得性突变的一组SAID。

2.2 发病机制研究

2.2.1 环境因素：3-AID患者暴露于寒冷的环境可能引起疾病发作。研究报道FCAS患者对寒冷的暴露十分敏感，会引起皮疹及其他疾病相关症状的发生，曾有研究显示FCAS的患者的外周血单核细胞在暴露于32 ℃后会自发分泌IL- 1β，而MWS的患者在冷暴露后也可能会引起皮疹、关节炎等症状。人们通过小鼠模型研究了3-AID的发病与外界环境温度的关系。+/小鼠外周血细胞暴露于32 ℃寒冷环境后，会出现自发性IL- 1β分泌增多，这与FCAS患者外周血单核细胞暴露于寒冷环境的结果是一致。与37 ℃环境温度相比，+/小鼠外周血细胞在暴露于32 ℃且有刺激剂脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)的情况下IL- 1β的水平上升，但没有刺激剂的情况下，这种小鼠模型的炎症因子水平没有因为温度降低而自发升高。这提示我们温度在3-AID的发病机制中可能是一个激活因素，但无法脱离炎症激活剂独立存在。

2.2.2 病理生理机制：携带人B30.2域突变的小鼠成为探索FMF病理生理机制的良好模型。这些小鼠模型被用于验证RhoA激活蛋白质激酶(protein kinase，PKN)1和PKN2并对炎素炎症小体产生抑制。Sharma等使用小鼠发现其自身炎症是由IL- 1β特异性介导的，而FMF发作有赖于Caspase- 1-ASC轴活化。该小鼠模型还被用于验证TNF与炎症小体协同作用放大炎症反应，提示炎素炎症小体介导的IL- 1β促进TNF的分泌，并可调节FMF的某些病理特征。

为了探索IL- 1β在炎症中发挥的作用，研究者们构建了不表达IL- 1受体(IL- 1 receptor，IL- 1r)的小鼠3//-，这种小鼠避免了新生致死，且体重相较于3350/+/小鼠及3//-小鼠显著上升，证明小鼠3-AID的表型部分依赖于IL- 1β。缺失IL- 18受体且携带3突变的年轻小鼠的皮肤炎症以及内脏炎症减轻，而衰老的小鼠将会出现严重的全身炎症，提示IL- 1与IL- 18在疾病的不同阶段发挥病理作用。

2.2.3 进化机制：炎素可能是先天免疫中特异的免疫传感器，基于这种猜想，有学者使用TALEN技术构建小鼠，证实了炎素作为感受器感知细菌内的Rho GTP酶的修饰，并形成炎症小体，发挥其在先天免疫中抗细菌的作用。2016年，研究者用FMF小鼠模型探讨了炎素炎症小体抵御病原体的机制，并提出这些突变可能是一把双刃剑，在抵御病原菌的入侵的同时引起自身炎症反应。研究发现，突变型炎素和野生型相比，前者与鼠疫耶尔森菌毒力因子YopM结合力变弱。动物研究证实，鼠疫耶尔森菌感染的小鼠和野生型敲入小鼠相比存活率更高，因此表明地中海人群中基因高突变率的发生可能是在进化上对鼠疫耶尔森菌的阳性选择结果。

2.3 治疗研究

2.3.1 已有药物：秋水仙碱是一种常用于治疗痛风的药物，同时也是一种RhoA激活剂，过去几十年被广泛用于治疗FMF。秋水仙碱可以使小鼠骨髓来源巨噬细胞中的IL- 1β水平降低，证明秋水仙碱可以抑制炎素炎症小体。富马酸二甲酯(dimethyl fumarate，DMF)是一种工业防腐原料，后来被用于治疗多发性硬化。研究发现，小鼠模型给药DMF后，小鼠的体重增加，脾大好转，同时IL- 1β的分泌及焦孔素D (gasdermin D，GSDMD)-N端的形成减少，提示DMF对FMF的潜在治疗作用。为了探究并发严重淀粉样变的-AID的治疗方法，研究者们新构建了小鼠。研究发现质子泵抑制剂可以显著改善3敲入小鼠的临床症状，并使淀粉样蛋白沉积消退，证明了这些药物可以尝试作为-AID的治疗药物。

2.3.2 探索新治疗：动物模型在探索SAIDs药物治疗新靶点方面发挥了重要作用。焦亡是细胞程序性死亡的途径之一，而GSDMD缺陷的FMF小鼠没有表现出炎症特征，提示焦亡介导了FMF的发病，可能作为FMF的治疗新靶点。

美国食品药品监督管理局已批准用于治疗3-AID的药物有IL- 1受体拮抗剂阿那白滞素(anakinra)、IL- 1受体融合蛋白雷纳西普(rilonacept)以及IL- 1β 单克隆抗体卡纳单抗(canakinumab)。但是这些药物价格昂贵并且可能增加感染的风险，因此构建NLRP3小鼠模型对于药物新靶点的发现至关重要。与传统的IL- 1靶向治疗相比，NLRP3抑制剂可能更加经济并具有治疗潜力。同时，IL- 18在炎症反应中发挥的作用也值得重视。目前，针对这些新靶点的动物实验正在-AID小鼠模型中开展。

3 单基因SAIDs动物模型的应用前景

单基因SAIDs因为只包含单个基因的突变，所以在构建基因工程实验动物方面有其独特优势。单基因SAIDs疾病谱不断扩展，例如2019年新命名的单基因SAIDs——抗裂解RIPK1诱导的自身炎症(cleavage-resistant RIPK1-induced autoinflammatory，CRIA)，不同的研究团队在探讨RIPK1、Caspase- 8以及RIPK3在其发病机制中的作用时，都使用了小鼠模型。动物模型也并非只有小鼠这一选择，与人类亲缘关系更为接近的猪，也可以被构建成为SAIDs动物模型。2020年，研究者们构建了NLRP3 R259W点突变猪模型，这种动物模型体内炎症通路与人类相似，可以作为一种理想的3-AID动物模型。除了猪，斑马鱼也曾作为SAIDs的动物模型。例如2020年新命名的VEXAS综合征(vacuoles，E1 enzyme，X-linked，autoinflammatory，somatic syndrome)，研究者们利用基因编辑的斑马鱼完成了体内实验的基因功能验证。此外，通过利用敲低斑马鱼内ADA2的表达，还证实了ADA2缺陷在DADA2发病中的作用。

小鼠模型是目前应用最广泛和研究最透彻的动物模型，小鼠模型属于哺乳动物，拥有繁殖力强、重复性好等优点。科学家们目前已经构建了很多单基因SAIDs的小鼠模型，并利用这些模型探究了SAIDs的遗传机制、发病机制与治疗靶点。但是单基因的疾病可能存在多种突变，构建单基因SAIDs的小鼠模型时研究者往往选择的都是人群中最常见的突变类型，不同突变的表型是存在一定差异的，这无疑会降低疾病模型的适用范围。另外，构建小鼠模型的突变一般是外国人群常见的基因突变类型，并不一定与中国人群疾病突变类型完全相同。因此有些未经证实的突变位点可通过构建携带相应突变的小鼠模型进行证实。在构建基因工程小鼠时，由于人与小鼠的遗传信息的不同或是技术的限制，小鼠模型可能无法达到预期表型。被广泛应用的SAIDs的基因工程小鼠也可以进行杂交等方法得到适合研究者应用的基因型和表型，应用于更多方面的探索。

进入21世纪，随着技术的不断发展，基因编辑工具的特异性和效率不断增高，高效且可以跨物种的基因编辑技术的出现使比较医学得到极大发展。动物模型相关数据库的出现提供了更多供研究者选择的动物模型。例如数据库Mouse Genome Informatics(http：//www.informatics.jax.org/)、JacksonLaboratory(https：//www.jax.org/cn/)和国家遗传工程小鼠资源库(http：//www.nrcmm.cn/)等。通过信息的整合，研究人员可以依据基因型和表型来选择适合自己研究的动物模型。

综上所述，通过多种动物模型，许多SAIDs的发病机制逐渐被阐明。随着技术的完善以及对于疾病认识的加深，研究者已经构建出同时拥有炎症表型和并发症的动物模型，用于SAIDs发病机制研究以及探索疾病治疗新靶点。虽然已经有其他种类的动物模型出现，但基因工程小鼠仍然是未来单基因SAIDs领域的应用热点。