皮肤屏障紧密连接在特应性皮炎发病机制中的作用

席榕，朱慧婷，李伯华，李龙朝，李萍，曲剑华

特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一种慢性、复发性、炎症性的皮肤病，主要以皮肤干燥、剧烈瘙痒、对称性的多形性皮肤损害为特征，影响全球约20%儿童和3%成人的健康，最近的数据表明，尤其是在低收入国家，AD的发病率仍在持续上升，已成为重要的健康问题。由于AD患者多伴有哮喘、过敏性鼻炎等其他特应性疾病，即对环境中常见抗原产生IgE类抗体应答的倾向性，故AD也被认为是一种系统性疾病。

AD的发病与环境及遗传因素关系密切，但具体原因尚不明确。过去数十年的研究过程提出过“卫生学假说”，“免疫紊乱inside-out假说”，“皮肤屏障受损outside-in假说”。随着越来越多的相关研究证实，皮肤屏障功能损害与AD发病的关系逐渐被研究者公认。其中表皮细胞紧密连接(tight junctions，TJ)在皮肤屏障功能中承担重要功能，其功能结构异常导致的皮肤屏障功能受损是AD发病的重要基础之一。

1 皮肤屏障的基本结构

皮肤屏障由诸多结构及成分组成，包括角质层(SC)相关结构、胞间脂质成分、桥粒、蛋白酶及其抑制剂、TJ结构等，构建起符合“砖-墙结构”的皮肤屏障模型。物理性的皮肤屏障主要局限于表皮的最上部，即SC。表皮通过角质形成细胞的终末分化持续角质化再生形成SC，角质形成细胞在角化过程中产生脂质并分泌至表层形成脂膜，完成分化的角质细胞与胞外成分紧密结合，形成初步的物理保护屏障。SC内各细胞膜间广泛交联，形成由丝聚蛋白(fillagrin，FLG)、内披蛋白(involucrin，IVL)、兜甲蛋白(loricrin，LOR)为主要成分的角质包膜，与SC共同成为皮肤屏障的“砖块”结构。水解后的丝聚蛋白有助于形成皮肤屏障的“天然保湿因子”等重要组分，以维持pH值，保湿和皮肤免受微生物侵害。角质细胞外的主要成分由疏水性的游离神经酰胺、游离脂肪酸和胆固醇等组成，即SC“砖-墙结构”中的灰浆，这些成分对于稳定皮肤屏障功能具有重要作用。角质细胞间的最主要连接结构由桥粒组成，此外还有更细的张力丝、跨膜连接丝形成交错连接的细丝网，使得细胞间形成一个连续结构的网，使相邻细胞间的关系更为牢固，形成 “钢筋”结构，维持皮肤屏障的稳定。除SC外，TJ是对皮肤屏障完整性必不可少的结构。在表皮角质形成细胞中，TJ以带状排列包裹桥粒，并与角质细胞中的角质形成桥粒联系在一起，密封SC中相邻的角质形成细胞，并作为通道蛋白参与皮肤与外界的跨膜转运。此外，蛋白酶及其抑制剂可分解角质细胞间的桥粒，使角质细胞脱落以达到不断更新角质和维持皮肤表面pH值的作用。这些成分协同作用以构建人体的最外层防线——皮肤屏障。

2 TJ的基本结构

作为皮肤屏障必不可少的功能结构，TJ几乎存在于所有表皮中，包括呼吸道、消化道上皮，甚至皮肤肿瘤中。TJ主要由Claudins(Cldns)家族、Occludin(Ocln)家族、Tricellin家族、JAMs家族、ZO蛋白、Mupp- 1、Cinglin和Symplekin组成，这些TJ蛋白的膜表达量与屏障的物理防御功能关系密切，多种TJ蛋白交互连接，形成TJ复合体，蛋白质复合物将细胞彼此连接或将细胞与细胞外基质连接，由ZO蛋白直接结合肌动蛋白，从而在细胞骨架和TJ复合体之间形成稳定的连接。TJ的结构稳定反映了屏障功能的完整性，TJ结构蛋白组成比例发生改变或受损均会导致胞间连接松散，细胞离散甚至脱落，屏障通透性增加，屏障内液体、细胞或细胞因子等逃逸，进而对机体造成损伤。故而TJ对于维持皮肤屏障的结构稳定和功能正常起着至关重要的作用。

3 TJ的功能

皮肤屏障功能由几个部分执行：微生物组，SC，TJ，化学屏障和免疫屏障，TJ位于这个复杂的屏障系统的中心，使得它们可以对刺激做出非常快速的反应，从而承担着更为重要的职能。TJ填补了细胞间的空隙，阻止了大部分外来抗原，并作为通道蛋白筛选可供交换的物质，降低不必要的免疫反应，对于维持皮肤内环境稳定有重大意义。除屏障功能外，目前研究已发现TJ蛋白与角质形成细胞的增殖，分化，细胞粘附、凋亡，表皮细胞脂质分泌及选择性物质交换有关，在皮肤屏障的组成中占据重要地位。

4 TJ参与AD发病的相关性

4.1 皮肤屏障受损

目前越来越多的证据表明，皮肤屏障破坏可能是AD致病的首发因素，SC通透性的增加、经表皮失水(TEWL)增多、SC水合作用的减少均会引发特应性皮炎。在正常皮肤中，TJ在上皮细胞与内皮细胞之间建立细胞旁屏障，对离子、水以及大分子和炎症细胞的细胞旁通透性起到一定的调节功能。Claudins蛋白是TJ的主要功能蛋白，对于维持皮肤屏障、TJ完整和表皮渗透功能正常具有重要作用。Furuse等将小鼠的claudin- 1基因敲除，发现这些小鼠在出生后1天内失水死亡。随后Kirschner等测量跨上皮电压和跨上皮电阻发现降低Cldn1、Cldn4、Ocln、ZO- 1的表达可增加离子和较大分子的细胞旁通透性，其中，Cldn1影响SC中水屏障相关蛋白质的表达，间接对表皮水屏障造成影响。日本研究者发现，Cldn1的表达在AD的临床特征中具有剂量依赖效应，皮肤上皮屏障功能和皮肤形态变化随Cldn1表达水平的降低而呈指数变化。Brunner等发现，无论是成人还是儿童，AD患者皮肤组织内TJ的关键成分——Cldns的表达均下调。由此可以看出TJ蛋白，尤其是Cldns家族对于正常皮肤屏障的建立有重要的调节和支持作用。

4.2 胞间脂质减少

细胞间脂质由神经酰胺、游离脂肪酸和胆固醇等主要成分组成，在颗粒层产生，到达SC时释放至体表，包裹在角质细胞外侧，对于SC有滋养润泽的保护作用。而表皮脂质含量不足从而导致水结合能力降低，TEWL增加和水分含量降低，是导致AD病情进展的重要因素。TJ可以在细胞顶端和细胞之间形成可调节的半透性物理屏障，该屏障可根据大小和电荷控制溶质的细胞旁转运，并限制脂质在顶端和基底外侧膜结构域之间扩散。目前已有充分证据显示3种主要脂质均对皮肤屏障有重要作用，特别是神经酰胺，对于SC的完整性有重要影响，AD患者的皮肤中神经酰胺的含量显著下降，且TEWL与神经酰胺含量呈负相关。现有研究发现，神经酰胺从前体到成熟脂质的加工过程中，需要两种酸性依赖性脂质水解酶：β-葡萄糖脑苷脂酶和酸性鞘磷脂酶。日本学者通过测定皮肤屏障破坏前后SC的pH值，发现TJ屏障破坏后pH值升高，对脂质加工有影响。Sugawara等通过敲除小鼠Cldn- 1基因，验证TJ功能障碍引起的细胞旁流入增加升高了周围细胞外环境中的pH，导致β-葡萄糖脑苷脂酶活性降低，从而间接影响脂质加工。以上研究表明TJ的结构异常可导致皮肤屏障破坏，内环境pH升高，影响脂酶的活性，导致SC脂质缺乏，从而进一步破坏皮肤屏障。

4.3 信号传导异常

目前已有研究结果显示TJ蛋白参与不同细胞水平的基因表达调控，可形成双向信号传递平台，从细胞内部接收信号，调节其装配和功能，并将信号转导至细胞内部。其中ZO- 1、ZO- 2可与转录因子结合，参与RNA的加工，通过隔离转录因子阻断基因表达过程，从而阻止细胞增殖和分化，抑制间质—上皮转化途径。Bissonnette等发现在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中ZO- 1和E-cadherin的表达水平降低，ZO- 1、ZO- 2及ZO- 1相关结合蛋白(ZONAB)在不同类型的侵袭性肿瘤中均出现表达失调的现象。ZO- 1的过表达和ZONAB的抑制会降低细胞增殖和密度，从而减少细胞周期调节因子D1介导的G1/S相进程，将TJ与关键的细胞周期调节因子及上皮细胞分化过程中的转录调控联系在一起。此外，细胞外刺激的受体，例如转化生长因子β和生长抑素，已被证实与TJ蛋白相关。ZO- 1表达减少与上皮细胞增殖或转化增加相关。现有研究成果已证实，在角膜创伤修复期间，以及在由β-连环素过度表达转化的结肠上皮细胞中，ZO- 1表达下调。Kuroda 等研究证明：TJ受损后，上皮细胞板层颗粒的极化分泌能力下降，各种脂质、蛋白酶和蛋白酶抑制剂分泌障碍，导致表皮细胞分化异常。对肠道上皮细胞的研究表明，ZONAB可能是通过抑制转录因子Runx1/AML1来实现抑制细胞分化的作用。以上研究均表明，ZO蛋白不仅作为TJ的骨架蛋白，而且广泛参与了TJ对于细胞信号传导的过程，TJ蛋白对于细胞迁移，增殖，分化和存活均有不同程度的调节。TJ的表达及定位异常均会导致细胞异常增殖和分化。

4.4 炎症反应增强

从发病机制看，AD似乎是破坏物理皮肤屏障并导致皮肤炎症的恶性循环。皮肤屏障功能的降低导致过敏原摄取的增加，从而激活免疫系统并导致以Th2免疫反应为主要特征的炎症。炎症发生后募集大量免疫细胞并分泌大量对TJ有抑制的细胞因子，进一步导致细胞屏障破坏和免疫反应加剧。De Benedetto等首次报告了关键性TJ蛋白——Cldn- 1在AD表皮中的表达显著降低，可能影响对环境变应原的免疫应答。日本研究者发现在降低Cldn1表达水平后，小鼠呈现出典型的AD形态特征，如嗜中性粒细胞和巨噬细胞募集等免疫应答反应，且这些小鼠成年后显示更强的接触超敏反应。Bergmann等发现了Cldn- 1降低诱导了角质形成细胞自主IL- 1β表达，并促进了对非致病性葡萄球菌的炎症表皮反应，从而诱发表皮发炎，增加Cldn- 1水平会改善屏障功能并减少炎症。日本学者对AD患者皮损处染色研究发现，AD患处皮损的HLA-DR含量比健康或非皮损AD皮肤中的增加了约5倍，且TJ穿透性明显增加，朗汉斯巨细胞出现极化分布并通过TJ延伸突触以捕获外部抗原，且免疫反应中产生的Th2/22等细胞因子均会对TJ及其关键成分Cldns产生负面影响。此外，免疫反应中产生的IL- 4和IL- 13会下调角质形成细胞中丝聚蛋白的表达，并加剧表皮屏障功能障碍。所以打破恶性循坏，减轻炎症反应是治疗AD的一个重要环节。Ludwig等已经证明，应用识别JAM-B和JAM-C的抗体可以减少变态反应性接触性皮炎小鼠的耳朵肿胀，减少中性粒细胞和T细胞从内皮细胞渗出。以上研究均表明，TJ的表达异常可引发皮肤屏障通透性提高，封闭性下降，导致机体免疫应答激活、超敏反应增强，进而破坏TJ结构，加重临床炎症反应症状。

5 调节TJ功能治疗AD

从发病机理来看，治疗AD的首要条件是打破屏障破坏——炎症刺激的恶性循环。尽管目前尚没有证据确定TJ是否是这个恶性循环的发起者，但修复TJ以达到打破恶性循坏，促进皮肤屏障修复，可为治疗AD提供新的思路。

TJ蛋白的表达是一个复杂的多信号传导的过程，是由各种衔接分子，如蛋白激酶、磷酸酶和GTP酶等介导的，它们又受涉及microRNA(miRNA)的调节和微调。目前研究证实，MicroRNA- 21诱导ras同源基因家族成员BmRNA降解，导致Ocln蛋白耗竭，TJ受损，且炎症组织中miRNA- 21水平升高，影响TJ的几个接头分子的表达。在上皮细胞屏障模型中，通过监测相关蛋白的表达和跨皮细胞阻力(TER)可以发现，miR- 203、miR- 483- 3p和miR- 595影响ZO- 2和蛋白激酶Cζ的表达，从而降低TJ的稳定性。研究表明，RhoA通过干扰TJ蛋白的合成而导致连接复合物破坏，RhoA的mRNA位点可被miR- 155特异性结合，且炎性细胞因子，如TNF-α和干扰素能够诱导miR- 155的表达，故炎症反应可以间接导致ZO- 1表达下调，TJ屏障受损。

6 中医药调节TJ功能

近年来已有一些研究证实，中药及其提取物可从修复TJ角度改善AD的皮损表现、降低皮肤炎症反应。玉屏风散被证实可降低IL- 4、IL- 5、IL- 13和IgE的产生，并有上调上皮细胞TJ(CLDN- 1和occludin)表达的功能，可通过修复TJ上皮屏障缺损，改善AD复发性变态反应性炎症。毛蕊异黄酮是中草药黄芪的活性成分，可有效地抑制过敏性炎症，毛蕊异黄酮可通过抑制TLR4介导的NF-κB信号通路，减少TSLP/IL- 33的分泌，减轻上皮TJ的破坏。对于卵清蛋白诱导的小鼠AD模型，口服芦荟多糖可恢复TJ基因的表达水平，并降低IL- 4、IL- 17的mRNA 转录水平，明显改善AD小鼠的皮损表现。Wang等发现防风的生物活性成分——升麻素对于AD模型小鼠的TSLP 和 IL- 33均有明显的抑制作用，并可通过增加TJ的表达以减少上皮细胞间的分离间隙。以上研究提示，中药可以通过调节TJ表达水平及功能活性，达到恢复皮肤屏障功能的效果，是中医药治疗AD的重要作用机制之一。

综上所述，AD是一种常见的慢性炎症性皮肤病，TJ功能异常是其发病的重要因素之一。TJ功能异常可导致皮肤屏障功能减弱，胞间信号传递异常，表皮细胞增殖分化异常；表皮的保水能力、皮肤弹性及机械性能降低，对于外界抗原的封闭性下降，从而导致抗原、半抗原对机体免疫系统的刺激，使机体处于高敏状态；同时TJ组织的破坏导致细胞间隙扩大，免疫细胞如朗汉斯巨细胞、炎性细胞等游走和迁移更加便利，更易于激活适应性免疫应答，分泌细胞因子破坏TJ结构，从而导致AD患者变态反应增强；而TJ表达减少导致皮肤表面pH值升高，影响脂质代谢酶的活性构成恶性循环，进一步导致AD病情恶化，从而出现皮肤干燥、瘙痒、脱屑等临床症状及体征，严重时干扰睡眠，甚至并发感染，严重影响患者的生活质量。故治疗AD可以采取减轻炎症反应，修复皮肤屏障为主的治疗思路。通过对TJ的研究，有助于进一步了解AD的发病机制，调节TJ蛋白的表达及组装，恢复TJ及皮肤的屏障功能可作为AD治疗及中医药干预的作用环节，中医药治疗AD具有良好的发展前景。以期为AD的预防、管理、治疗提供新的治疗思路，为新药研发和疾病治疗提供新的思路。