微生态疗法在特应性皮炎的应用及其治疗机制

周园，姚煦

皮肤是人体最大的器官，其上定植着种类繁多、数量巨大的微生物群落。表皮屏障、免疫系统和皮肤菌群之间协同合作，共同维护人体的皮肤健康。皮肤菌群紊乱在特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)等炎症性皮肤病的发生、发展中发挥着重要作用。在AD患者，致病性金黄色葡萄球菌(，)优势定植，皮肤共生菌多样性下降，从而导致宿主皮肤屏障破坏以及免疫系统失衡。口服或局部应用抗生素适用于皮肤继发性细菌感染，但是不能预防AD的复发。在AD患者中广泛外用抗生素可导致特殊耐药菌株的出现，同时容易破坏体表正常的微生态系统，进一步加重AD患者的皮肤菌群紊乱。微生态疗法基于AD患者致病性以及各类皮肤共生菌的作用机制，靶向修饰皮肤常驻菌群，选择性杀灭或抑制致病菌，改善皮肤屏障并调节免疫平衡，为AD的预防与治疗提供了全新的途径。

1 S.aureus在AD的流行病学研究

约20%的健康人群存在的表皮定植，而在AD患者中的定植率可达30%～100%。近期针对95项基于培养学方法的观察性研究的Meta分析结果显示，AD患者皮损与非皮损处的携带率分别为70%和39%，并且的异常定植与AD皮损的严重程度呈正相关性。在婴儿AD，有研究显示的定植早于AD的发生，提示早期皮肤定植与婴儿后期临床AD的发生密切相关。菌株水平的宏基因组学分析结果进一步显示，AD患者定植的菌株呈单克隆性。与正常人皮肤分离的菌株相比，这种AD单克隆性分离株在小鼠表皮定植模型中诱导更严重的皮肤炎症反应，提示其更强的致病性。

2 S.aureus的致病机制

分泌的α毒素是一种水溶性细胞毒素，可以直接在KC表面形成穿孔，从而破坏皮肤屏障。合成并分泌10种主要的蛋白酶，包括1种丝氨酸蛋白酶(V8蛋白酶)、1种金属蛋白酶、2种半胱氨酸蛋白酶(staphopain A和B)以及6种丝氨酸蛋白酶样蛋白(SplA-F)。这些蛋白酶溶解并穿透宿主角质层，进一步破坏上皮屏障的完整性。此外，还可以刺激宿主KC产生内源性蛋白酶，包括激肽释放酶(kallikrein，KLK)6、KLK13和KLK14，提示破坏皮肤屏障的另一种机制。

脂蛋白通过激活人原代KC表面的Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)2/TLR6，诱导其产生胸腺基质淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)，从而促进AD中Th2型炎症。Saito等研究发现脂蛋白可以被真皮树突状细胞(dendritic cell，DC)表面的TLR2识别，促使真皮DC的迁移以及下游效应T细胞(effector T cell，Teff)的皮肤浸润，揭示了脂蛋白通过DC-Teff轴建立皮肤炎症的新机制。蛋白酶SplD亦可作为细菌过敏原诱导产生SplD特异性IgE。与屋尘螨及其提取物等其他具有蛋白酶活性的过敏原不同，SplD并不诱导产生TSLP、IL- 25或GM-CSF，而是刺激宿主免疫细胞产生IL- 5、IL- 33等细胞因子，加重Th2型炎症反应。所有菌株均表达超抗原，如葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxin，SE)A、SEB、中毒性休克综合征毒素(toxic shock syndrome toxin- 1，TSST- 1)等，引起细胞因子释放、B细胞增殖并可作为过敏原诱导产生抗原特异性IgE。

酚溶性调节蛋白(phenol-soluble modulins，PSMs)是最重要的毒力因子之一，包括一组细胞毒性肽PSMα1- 4、PSMβ1- 2、PSMγ(亦称为δ毒素)以及PSM-mec。Syed等发现PSMs在小鼠表皮定植模型中可诱导KC促炎细胞因子IL- 18的表达，证明了PSMs在介导的皮肤炎症中的重要作用。在小鼠定植模型中，δ毒素诱导肥大细胞脱颗粒，促进IgE水平升高和Th2型皮肤炎症。PSMα则可以诱导KC产生IL- 1α和IL- 36α，募集γδ T细胞以及3型固有淋巴样细胞产生IL- 17，从而触发皮肤炎症反应。

分泌PSMs的过程受到辅助基因调节(accessory gene regulator，Agr)群体感应系统的调控。Agr系统包括RNAII和RNAIII两个相邻的转录本，其中RNAIII可同时上调α毒素及多种蛋白酶的表达。Nakamura等在未发生AD的患儿中观察到Agr基因突变且功能异常的菌株，提示功能完整的Agr系统是表皮定植并诱导AD样皮肤炎症的必要条件。因此，干预上游Agr系统是限制AD患者中定植与毒力的重要靶点。

3 微生态疗法

3.1 皮肤特定菌群移植

AD患者皮肤菌群多样性下降，对人体有益的皮肤共生菌减少。Paetzold等将含有多种细菌的混合溶液应用至健康志愿者皮肤，结果显示受试者皮肤菌群的组成变得与供体更相似，证明了皮肤菌群移植在调节皮肤微生物组成中的可行性。包括表皮葡萄球菌(，)在内的多种凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase-negative Staphylococci，CoNS)可产生抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)特异性杀灭，并与宿主内源性AMP LL- 37发挥协同抗菌作用。在AD患者和健康人群皮肤分离得到大量CoNS菌株，高通量筛选针对的抗菌活性株，结果显示具有抗菌活性的CoNS菌株在AD患者中明显减少，而在AD患者中重新引入活性CoNS菌株则可以有效降低的定植。在随后进行的一项随机双盲临床试验中，Nakatsuji等从AD患者非皮损处筛选获得具有抗菌活性的CoNS，在体外扩增后进行自体菌群移植，重新应用至AD患者皮肤表面，随访结果显示该疗法患者耐受性良好，定植降低，AD患者疾病严重程度明显改善。Myles等将从健康人获得的皮肤共生菌黏液玫瑰单胞菌(，)应用于AD小鼠模型以及AD患者，均获得一定的治疗效果。

Teme79小鼠自发形成Th17细胞介导的皮肤炎症。皮肤微生物组比较分析发现其疾病活动指数与皮肤科氏葡萄球菌(，)数量呈负相关。局部应用分离自小鼠或人体的可有效预防或改善Teme79小鼠的皮肤炎症，而在MC903诱导的AD小鼠模型中同样有效。进一步研究则显示可激活宿主糖皮质激素相关通路并诱导皮肤抗炎基因的表达。这提示作为微生物制剂在治疗皮肤炎症中的巨大潜力。

此外，多种CoNS可产生信号分子自体诱导肽(autoinducing peptides，AIPs)竞争性抑制的Agr系统，但这存在高度的菌株依赖性。山羊葡萄球菌()可分泌一种八肽的AIP(YSTCSYYF)，阻断Agr毒力系统，减轻感染引起的小鼠皮肤坏死性损伤和表皮致病菌负荷。另一种CoNS人葡萄球菌(，)则通过分泌AIP(SYNVCGGYF)抑制Agr毒力，预防介导的小鼠表皮损伤和皮肤炎症。随后该团队根据各种CoNS菌株对生长及毒力因子的抑制能力，进一步分离筛选出菌株ShA9。外用ShA9治疗AD患者后，所有菌株的毒力因子PSMα的表达均被抑制，定植减少。同时部分患者的被ShA9直接杀灭，该部分患者皮损得到有效改善。该项一期临床试验的成功揭示了皮肤菌群移植在AD治疗中的安全性及潜在价值。

3.2 噬菌体与内溶素疗法

来源于噬菌体的内溶素疗法可以选择性根除皮肤定植。内溶素是噬菌体产生的针对细菌的细胞壁水解酶。噬菌体及其内溶素具有高度特异性，选择性杀死致病菌而不影响其他皮肤共生菌。Staphefekt是商品化的重组噬菌体内溶素，专门针对皮肤局部用药。早期病例报告表明外用Staphefekt可缓解传统治疗无效的AD皮损症状。但在随后的100名中重度AD患者中进行的Staphefekt与安慰剂对照的随机双盲临床试验中，治疗组与对照组在定植、临床疗效、生活质量等方面没有统计学差异。作者分析这可能与未合理筛选定植增加的AD患者、外用皮质类固醇激素减轻皮损严重程度而掩盖Staphefekt疗效等因素有关。

Shimamori等从污水样本中分离出一种新型噬菌体SaGU1，可在体外广泛杀灭来源于AD患者皮肤的多种临床分离株，但不影响皮肤共生菌的存活。SaGU1与联用可减少耐噬菌体的出现，增强SaGU1的杀菌作用。在二硝基甲苯致敏联合定植的AD小鼠模型中，外用SaGU1或均可显著减少定植并降低血清IgE水平，但两者尚未发现明显协同作用。对于存在定植增加的AD患者，噬菌体疗法以及噬菌体联合皮肤共生菌是AD治疗的一种新选择。

3.3 S.aureus疫苗

鉴于可以产生多种表面抗原及毒力因子，靶向单个抗原的疫苗无法刺激机体产生充分的免疫反应以达到预防感染的作用。目前针对的多个疫苗在临床试验中均未见到显著成效。基于抗体的主动疫苗接种对其他机会性细菌(如肺炎链球菌和流感嗜血杆菌)有效，但对无效。如何刺激机体产生有效的细胞与体液免疫是疫苗研发的重点与难点。越来越多的证据表明不同的T细胞亚群通过协调下游细胞吞噬反应，限制在不同部位的定植与感染。由Th1细胞分泌的γ干扰素所介导的巨噬细胞反应在血液感染的清除与免疫记忆的产生中至关重要，而产生IL- 17的γδT细胞和Th17细胞则在皮肤部位发挥作用。最近的研究发现皮肤引流淋巴结中存在产生肿瘤坏死因子和γ干扰素的γδT细胞，可以预防后续的皮肤侵袭。由于不同部位的T细胞亚群的组织特异性，下一代抗疫苗应靶向特定Teff亚群并诱导产生充分的抗毒素中和抗体。尽管抗疫苗尚未在AD患者中进行临床试验，但这可能代表了一种调节AD皮肤菌群的新方法。

4 现状与展望

皮肤菌群紊乱在AD的致病机制中发挥重要作用，包括的定植增加以及皮肤共生菌群的相对减少。微生态疗法靶向调整皮肤菌群组成已成为AD局部治疗的新兴策略。微生态疗法的最终目的不是完全根除致病菌，而是恢复其菌群多样性，实现皮肤菌群的生态平衡。

目前“有益”皮肤共生菌移植在AD中的治疗作用已初现曙光，疫苗、噬菌体及其衍生的内溶素疗法亦方兴未艾。然而，许多研究仍处于初步阶段，微生态疗法治疗AD的长期安全性及有效性尚未可知。值得注意的是，现有的皮肤菌群移植多立足于单一菌种或菌株，而非真正意义上的微生物群体移植。皮肤表面是一个复杂的生态系统，真实世界中单一菌种的作用有限，这从二期临床试验的失败中可见一斑。利用宏基因组学深入分析健康人群与AD患者的菌群差异、菌株异质性，准确定义“健康菌群”的概念，同时进一步了解与宿主免疫系统的相互作用机制。这是定向修饰皮肤菌群从而达到AD精准治疗的理论基础。

对于已进入临床试验的微生物制剂，仍需进一步优化患者选择、药物活性和治疗持续时间，克服停药后的快速重新定植，以实现最终可能成为常规的安全、可持续的临床治疗选择，真正开创AD治疗的后生物制剂时代。