以多孔金电极为传感界面的电化学双标记免疫传感器研究*

2022-10-08毕烩元沈燕婷刘云龙李景晨沈红霞

广州化工 2022年17期

毕烩元，沈燕婷，詹颜，刘云龙，何涛，李景晨，沈红霞

(1 嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江嘉兴 314001；2 嘉兴市第二医院，浙江嘉兴 314001)

肿瘤标志物[1]的精确和早期诊断可以大大提高治疗癌症的成功率。当前，肿瘤检测多为针对单一肿瘤标志物，而多肿瘤标志物同时检测可显著提高诊断灵敏度、特异性和准确度。因而开发高灵敏、简便、快速的检测方法对抗原或抗体的检测具有重要的理论意义和实际应用价值[2-3]。

电化学免疫传感器已广泛地应用在医学临床诊断、环境监测和食品工业等领域[4]。多孔纳米金具有大的比表面积、良好的生物相容性，能负载更多抗体，可以有效地实现信号的放大，提高其检测灵敏度和稳定性。而且以不同的电活性物对抗体进行电化学标记，可实现多种抗原的同时检测[5-6]。

我们采用夹心法检测抗原。探讨硫堇和中性红为电活性物质，以多孔金电极为固相加载抗体。将硫堇和中性红两种电活性物质分别标记羊抗鼠和羊抗兔抗体，抗体抗原特异性结合，利用CV和DPV检测两者还原峰的大小。根据在不同电位的响应信号的变化，间接地反映抗原抗体结合的信息，实现抗原的分析测定。

1 实验内容

1.1 实验材料

化学药剂：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、L-半胱氨酸、戊二醛、氯金酸、硫堇、硫酸、无水碳酸钠等溶液均为优级纯或分析纯;所有用水均为去离子水。

仪器设备：扫描电镜,日本日立公司；电化学工作站,上海辰华仪器公司。

1.2 材料制备

在三颈瓶中加入195 mL二次水和4 mL 25 mM的氯金酸，开始加热并搅拌，直至溶液沸腾，快速加入10 mM 柠檬酸钠，溶液变色后，边搅拌边冷却至室温。可制得粒径范围在10～100 nm的AuNPs[7]。再分别制备羊抗兔抗体、羊抗鼠抗体、不同浓度的正常兔抗原、不同浓度的正常鼠抗原等。

1.3 电化学标记

硫堇的还原峰[8]在-0.2～0 V左右，中性红的还原峰[9]在-0.5 V左右。TH以Au-S键为基础，形成Au纳米溶胶-电活性物质-抗体复合物[10]。通过将NR的氨基与戊二醛的醛基相连，再与羊抗兔抗体上的氨基相连，从而形成NR标记的NR-戊二醛-羊抗兔抗体。

1.4 多孔金电极的制备

在Na2CO3溶液中，以KAu(CN)2和KAg(CN)2为原料，采用电化学还原法在金电极表面沉积金银合金膜，然后将电极浸泡在硝酸溶液中去合金化，较活泼的Ag被溶解，从而制备了高比表面积的多孔纳米金电极。

1.5 制备电化学免疫传感器

金电极用L-半胱氨酸修饰，再用戊二醛交联L-半胱氨酸与抗体结合，用BSA封闭过夜，然后与抗原特异性结合，最后与Au纳米溶胶-电活性物质-抗体复合物上的抗体特异性结合，构建成电化学免疫夹心传感器。用三电极进行检测，工作电极-免疫夹心金电极，参比电极-银/氯化银电极，对电极-铂电极；用控制变量法，保证其他的量不变，只改变正常兔抗原和正常鼠抗原的浓度，依次测量不同抗原浓度下，电化学信号的变化。

2 结果与讨论

2.1 SEM表征

扫描电镜(SEM)结果如图1，图2所示。

图1 纳米金溶胶的SEM图像

图2 多孔金电极表面的SEM图像

由图1可知制备得到的Au纳米呈椭球状，其形貌较均一，分散性好，有较大的比表面积，能够维持生物分子的活性，表面带负电可以静电吸附较多的抗原或抗体，是制作免疫传感器固载物的较优选择。

图2清楚地看到制备所得的多孔金电极的表面，分布着大量纳米级小孔，这使得金电极比表面积大大增加，提高了检测灵敏度。

2.2 电活性标记物的电化学性质

电活性标记物的氧化和还原峰的位置如图3和图4所示。

图3 中性红的循环伏安(CV)曲线

图4 硫堇的循环伏安(CV)曲线

如图3所示，表明中性红的氧化峰电位在-0.55 V左右，还原峰电位在-0.5 V左右。

如图4所示，表明硫堇的氧化峰电位在-0.2 V左右，还原峰电位在-0.1 V左右。

2.3 以多孔金电极为传感介质的电化学传感器DPV表征

配置系列浓度的正常兔抗原和正常鼠抗原，构成免疫夹心传感器。用DPV测试不同正常抗原浓度的响应电流ip。得到的组装有NR和TH的双标记电化学免疫传感器抗原浓度的电流响应曲线，实现了两种不同抗原的同时检测，如图5所示。

图5 双标记电化学传感器不同抗原浓度的电流响应

如图5所示，出现的二个峰分别是NR和TH的信号。表明可以同时测出所对应的二种抗原浓度。进一步的实验表明在相同抗原浓度时，多孔金电极时的信号比普通金电极高。证明了多孔金电极比表面积较大，从而检测灵敏度更高。

2.4 以多孔金电极为传感界面时抗原线性范围和检测限

如图6所示，其中两种抗原浓度分别为0.1、1、12.5、62.5、75、100、200 ng/mL。在1～100 ng范围内随着抗原浓度增大，电流信号(ip)增强，表明在这个抗原浓度范围内，该免疫传感器有较好的检测效果。其中0.1 ng/mL和200 ng/mL时已明显偏离线性。由此我们确定线性范围为1～100 ng/mL。