不同严重程度哮喘患者诱导痰IL-25与临床指标的相关性分析

尹辛大 张华

白细胞介素-25(interleukin-25，IL-25)是IL-17家族的成员，在气道中主要由支气管上皮细胞产生，其他来源包括嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞[1]。IL-25通过产生IL-4、IL-5和IL-13促进和增强Th2型过敏性炎症，导致血清IgE浓度升高、气道嗜酸性粒细胞增多和气道高反应，因此被认为是过敏反应的重要标志物[2-3]。目前关于IL-25在哮喘中作用的研究显示，哮喘性支气管炎患者血清IL-25表达增加[4]，过敏原诱导的IL-25在过敏性哮喘患者中的表达与疾病严重程度相关[5]。本研究旨在评估诱导痰(inducedsputum，IS)中IL-25mRNA和蛋白质在不同哮喘表型和疾病严重程度患者中的表达，分析其与哮喘临床特征和相关指标间的关系。

资料与方法

一、一般资料

选取2020年3月～2021年3月我院诊治的哮喘患者，纳入标准：①年龄>18岁，②符合《支气管哮喘防治指南(2020年版)》对支气管哮喘的诊断[6]；③临床资料完整。排除标准：①3个月内出现有症状的呼吸道感染；②接受全身糖皮质激素治疗后哮喘加重；③合并其他重要脏器损伤、肿瘤及其他神经系统疾病。哮喘严重程度的评估，根据指南进行，咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma，CVA)定义为以咳嗽为唯一症状，持续至少8周，肺功能正常，无气道阻塞，支气管激发试验阳性。所有哮喘患者均接受以下评估：病史、体格检查、最大呼气流量-容积曲线及肺活量测定、支气管激发试验、皮肤点刺试验和诱导痰试验。对照组由无阻塞性肺疾病或过敏史的健康非吸烟受试者组成。本研究方案得到医院伦理委员会的批准(ZBZXYY-018)。参与研究的所有患者均签署了知情同意书。

二、实验方法

1 诱导痰试验 诱导痰前吸入400μg沙丁胺醇，随后进行肺功能测试。在支气管扩张后测定肺活量，患者在室温下通过超声雾化器吸入无菌高渗盐水(NaCl)，并增加浓度(3%、4%和5%溶液)。每次吸入的持续时间为7 min。每次吸入后重复肺活量测定。在FEV1比基线(吸入沙丁胺醇后)FEV1值降低至少20%后，停止诱导。

2 诱导痰样本处理 在收到诱导痰后立即进行处理，测量痰容积，分离并称重。将新制备的0.1%二硫苏糖醇(DTT，江苏普乐司生物科技)溶液加入无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，体积等于样本量的1/4，摇匀15 min。随后加双倍体积的无菌PBS并短暂搅拌。通过70μm细胞过滤器(上海晶安生物科技有限公司)过滤后，将样本在1800 g下离心10 min。在改进Neubauer型细胞计数板(北京世联博研科技)中计数细胞，评估死亡细胞和上皮细胞(鳞状上皮细胞和纤毛上皮细胞)的百分比。计算总细胞计数(106细胞/g痰)。将细胞颗粒悬浮在RNAlater溶液(赛默飞世尔科技)中，并储存在-80 ℃下进行进一步研究。涂片用MayGrünwald-Giemsa染色。合适的IS质量为：一张玻片上，上皮细胞<50%，非上皮细胞>300个。

3 RNA的提取与cDNA的合成 使用RNA柱式提取试剂盒(赛默飞世尔科技)从IS细胞中分离总RNA。在分光光度计上测量分离RNA的浓度和纯度。使用SuperScriptIII逆转录酶对14 μL总RNA进行反转录，产物用于实时定量PCR。

4 实时定量PCR 使用ABIPrism7500序列检测系统(美国福斯特市应用生物系统公司)进行实时定量PCR评估：在16 μL的PCR体积中扩增0.8 μL的cDNA，其中包含带有150 nm特异性引物的SYBRGreen实时荧光定量PCR预混液(赛默飞世尔科技)。为使基因表达水平正常化，对每个样本应用18srRNA作为内部对照。应用的引物序列如下：IL-25：正向5′-TGGTCCCTTTGGGAACC-3′，反向5′-TGTGCAGAGTGCAGGCTTT-3′(153bp)，18srRNA：正向5′-GGATGAGGGGAACGTGTGT-3′，反向5′-AGGTTCTCTCCAGGAGCTTG-3′(148bp)。每个样品测量两次，结果以相对定量单位(差异倍数)表示。相对定量值使用2-ΔΔCT法，内源性对照采用18SrRNA。在计算中，观察组和对照组痰细胞cDNA的周期阈值(CTs)用健康志愿者痰细胞的平均CTs进行校准。

5 蛋白质浓度测定 根据制造商的说明，使用ELISAminiVidas生物梅里埃全自动荧光免疫分析仪(法国Marcy-léoile)评估总IgE浓度，使用ELISA试剂盒(武汉伊艾博)测量IS上清液中的IL-25浓度。试验的平均最低检测水平为10 pg/mL。观察两组IS上清液中IL-25蛋白质的浓度。

三、统计分析

应用SPSS25.0统计软件数据分析，不符合正态分布的计量资料以中位数(四分位数间距)[M(QR)]表示，使用秩和检验进行比较；计数资料采用n(%)描述，使用χ2检验或Fisher精确检验进行比较。相关性采用Spearman秩检验分析。建立受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线，并计算IS中IL-25mRNA和蛋白质表达水平的临界值、曲线下面积(area under curve，AUC)、敏感性和特异性。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、患者一般特征

观察组共纳入哮喘患者76例，其中男13例，女63例，轻中度哮喘22例，重度哮喘28例，CVA 26例，40例(53%)患者接受了吸入性糖皮质激素(Inhaled corticosteroids，ICS)和长效β2-激动剂的联合治疗，36例(47%)患者仅根据需要接受短效β2-激动剂治疗。对照组FEV1%，上皮细胞和嗜酸性粒细胞百分比明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

表1 两组的人口学、临床资料和诱导痰细胞组成

二、不同组别IL-25mRNA的表达及蛋白浓度

对照组和观察组mRNA表达分别为[1.09(0.1，8.04)]差异倍数和[0.46(0.06，3.06)]差异倍数；对照组和哮喘组IL-25蛋白浓度分别为[314.9(237.6，418.5)] pg/mL和[399.2(320.6，585.9)] pg/mL，差异均无统计学意义(P>0.05)。通过对哮喘各亚组的分析显示，不同亚组IL-25mRNA表达和蛋白浓度的整体比较，差异无统计学意义(P>0.05)，两两比较，中重症哮喘患者IL-25mRNA表达水平低于对照组[1.09(0.10，8.04)]差异倍数和CVA[0.85(0.22，18.70)]差异倍数。重症哮喘患者IL-25蛋白浓度[571.20(451.00，633.80)] pg/mL显著高于对照组[314.85(237.6，481.5)] pg/mL，CVA[(386.5(327.3，446.1)] pg/mL和轻中度哮喘组[340.6(267.1，407.5)] pg/mL(见图1)。

图1 不同组别IL-25mRNA表达(A)和蛋白浓度(B)比较

三、IL-25mRNA表达和蛋白浓度对哮喘诊断的ROC分析

IL-25mRNA表达和蛋白浓度对哮喘诊断的敏感性和特异性均较低。IL-25的临界值为：mRNA表达0.76差异倍数(灵敏度66%，特异性50%，AUC=0.598)，蛋白质浓度288 pg/mL(灵敏度81%，特异性50%，AUC=0.618)。根据临界值的分析表明，IL-25 mRNA高表达患者，嗜酸性粒细胞百分比显著降低，病程缩短，FEV1/FVC比率较高，IL-25蛋白高浓度患者中性粒细胞百分比增加(见表2)。

表2 痰IL-25mRNA和IL-25蛋白水平对哮喘鉴别价值分析[M(QR)]

四、嗜酸性粒细胞百分比分级的IL-25mRNA表达及蛋白浓度比较

在不同嗜酸性粒细胞百分比亚组的哮喘患者中，IS嗜酸性粒细胞百分比≥3%的患者IL-25mRNA表达明显高于<3%者，差异有统计学意义(P<0.05)(见表3)。

表3 嗜酸性粒细胞百分比分级的IL-25mRNA表达及蛋白浓度[M(QR)]

五、过敏性哮喘患者IL-25 mRNA表达及蛋白浓度比较

临床特征的分析显示，所有哮喘患者中IL-25mRNA表达和IL-25蛋白浓度与疾病持续时间(mRNA：r=-0.31，P=0.09；蛋白浓度：r=0.18，P=0.31)，FEV1%预计值(mRNA：r=0.31、P=0.1；蛋白浓度：r=-0.22、P=0.22)，血清IgE水平(mRNA：r=-0.13、P=0.46；蛋白浓度：r=-0.08、P=0.63)和每日ICS剂量(mRNA：-0.312，P=0.08；蛋白浓度：r=0.305，P=0.07)无显著相关。亚组比较显示过敏性哮喘患者IL-25蛋白浓度显著高于非过敏性哮喘患者(P=0.03)，IL-25mRNA表达与IS嗜酸性粒细胞计数以及血清IgE浓度呈负相关，IL-25蛋白浓度与IS中性粒细胞计数呈正相关(见表4，5)。

表4 诱导痰细胞和IL-25表达及蛋白浓度比较[M(QR)]

讨 论

本研究表明，重度哮喘患者是唯一一个与对照组相比IS IL-25蛋白浓度升高，IL-25mRNA表达降低的亚组，哮喘患者IS中IL-25与嗜酸性粒细胞减少和中性粒细胞百分比升高有关，ROC分析显示IS IL-25在诊断哮喘方面效率低下，进一步表明IL-25可能仅与某些哮喘表型或严重阶段相关。与An等证实IL-25与严重哮喘的发病机制有关的研究结果一致[7]。本研究还证实了IL-25蛋白浓度与过敏性哮喘的关系，Zheng等研究表明过敏原诱导的IL-25在过敏性哮喘患者中的表达与疾病严重程度相关[8]。根据以往IS细胞中mRNA表达的研究结果，IL-5、IL-17A、IL-25高的患者，痰嗜酸性粒细胞和中性粒细胞增多，肺功能参数较差，哮喘病情控制较差[9-10]。在上述研究的背景下，本研究结果可以被视为新的数据，证实了IL-25与严重哮喘之间的关系。

IL-25的主要来源是表达IL-25的上皮细胞，嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞等炎症细胞在过敏、病毒或寄生虫刺激后，也能够产生和分泌IL-25[11-12]。本研究显示，IL-25 PCR和ELISA结果之间存在显著差异，单个亚组患者的IL-25 mRNA表达和蛋白浓度均为反向，严重哮喘和过敏性哮喘患者IL-25 mRNA水平较低，蛋白浓度较高，这种现象的机制目前还尚未阐明，可能与在IS上清液中测量蛋白质水平，而在从IS分离的细胞中评估mRNA表达有关。此外，本研究认为严重哮喘患者IL-25 mRNA表达几乎被完全抑制可能与这些患者接受ICS治疗有关。纳入的所有重度哮喘患者均接受了ICS治疗，而糖皮质激素治疗可减少嗜酸性粒细胞的数量，降低哮喘气道中炎症介质的水平。此外，有研究显示，严重哮喘患者糖皮质激素受体表达降低和p65基因启动子募集减弱，可导致气道平滑肌细胞对糖皮质激素不敏感[13]，因此，PCR和ELISA结果之间的差异也可能与存在其他糖皮质激素不敏感的IL-25来源有关，例如某些结构性气道细胞。

本研究中，过敏性哮喘患者的IL-25水平升高，但与以血清IgE水平或IS嗜酸性粒细胞计数增加的Th2型炎症反应无关。此外，较高的IL-25蛋白浓度与较高的中性粒细胞百分比相关，说明IL-25可能具有多效性，与其他研究结果相似。一项研究表明，IL-25诱导了IL-17A依赖性哮喘小鼠气道中性粒细胞模型，在不同的哮喘小鼠模型中，IL-25激活NF-κB并产生CXCL8，CXCL8是一种强中性粒细胞趋化因子[14]。王若珺等证明IL-17RA和IL-17RB人中性粒细胞表面的表达[15]。本研究发现IS IL-25水平和增加的中性粒细胞百分比之间的关系与IL-25的趋化活性相关，导致中性粒细胞重新进入气道。接下来的研究还需要对IS中IL-25来源进行更详细的分析，以正确解释本研究的发现。综上所述，哮喘患者和健康受试者的IS中IL-25无显著差异，但IL-25与严重哮喘相关。IL-25与粒细胞气道炎症之间的关系表明，IL-25在该疾病的免疫反应中具有多效性作用。