IL-17A、IL-6、IFN-γ在卵巢癌的表达情况及相关性研究*

殷美琴，王永霞△，秦智娟，李美琴，马宗丽，沈晓健，薛卫红，沙红兰

(如皋市人民医院：1.妇产科；2.病理科，江苏南通 226500)

卵巢癌对女性健康的威胁日趋严重，病死率是妇科肿瘤之首[1-2]。这与现今依然缺乏早期筛查手段及有效的治疗措施密切相关。研究已经发现卵巢癌的生存率与肿瘤分期密切相关，分期越高，生存率越低[3]。因此，卵巢癌的早期诊断尤为重要。

炎症在肿瘤中的作用被广泛关注[4]。白细胞介素(IL)-17A是一种重要的炎症介质[5]，一方面可以诱导IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等表达，另一方面又能同肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等协同作用，放大其致炎效应。但目前只发现IL-17A在炎性反应、自身免疫性疾病、部分肿瘤中发挥重要作用，与卵巢癌相关的研究较少。IL-6则是机体免疫应答和炎性反应的双重调节因子，参与多种肿瘤的发生、发展。干扰素(IFN)具有广泛的生物学功能，可以调节机体免疫、参与抗肿瘤等，IFN-γ能够抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长。目前关于细胞因子和卵巢癌的研究集中在对卵巢癌患者血清相关因子的测定，对卵巢癌组织中细胞因子表达水平的研究较少，且尚未发现IL-17A、IL-6、IFN-γ三者在卵巢癌中关系的研究。因此，本研究采用免疫组织化学分析检测对照组织、卵巢良性上皮性肿瘤、卵巢癌组织中IL-17A、IL-6、IFN-γ蛋白的表达情况，通过ELISA检测血清IL-17A、IL-6、IFN-γ蛋白的表达水平，最后分析IL-17A、IL-6、IFN-γ蛋白三者间的相关性，以期为卵巢癌的早期诊断及抗卵巢癌的药物靶点提供新思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年5月至2020年5月如皋市人民医院就诊的50例患者为研究对象，其中30例上皮性卵巢癌患者作为卵巢癌组，20例卵巢上皮性良性肿瘤患者作为良性肿瘤组，另选取同期因子宫肌瘤行全子宫+附件切除术且卵巢正常的20例患者作为对照组。卵巢癌患者纳入标准：(1)30～70岁；(2)所有病例均符合卵巢癌病理分类标准和2014年国际妇产科联盟(FIGO)分期标准诊断标准；(3)手术均按2015年美国国立综合癌症网络(NCCN)卵巢癌指南规范的卵巢癌分期手术或卵巢癌减瘤术；(4)手术前均未行化疗、放疗及免疫治疗。卵巢癌患者排除标准：(1)肿瘤非卵巢原发；(2)正在服用免疫抑制剂、免疫调节剂及糖皮质激素者；(3)存在恶性肿瘤、自身免疫性疾病等其他疾病者。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1主要试剂

DAB显色试剂盒(AR1002)、聚合辣根过氧化物酶(HRP)标记抗小鼠IgG(SV0001)、聚合HRP标记抗兔IgG(SV0002)购自武汉博士德生物工程有限公司；抗IL-17A抗体(ab79056)、抗IL-6抗体(ab9324)、抗IFN-γ抗体(IFNG/466，ab218426)、人IL-17A ELISA Kit (ab216167)、人IL-6 ELISA Kit (ab178013)、人IFN-γ ELISA Kit (ab46025)购自英国Abcam公司。

1.2.2石蜡切片

将组织常规方法制作石蜡切片，切片厚度4 μm。

1.2.3苏木素-伊红(HE)染色

常规程序脱蜡染色，其中苏木素液染色约10 min，水洗蓝化20 min，伊红液染1 s。

1.2.4免疫组织化学染色

切片脱蜡至水。过氧化氢(H2O2)孵育10 min，ddH2O洗涤5 min。枸橼酸盐抗原微波炉热修复。磷酸盐缓冲液(PBS)洗净5 min。5%BSA室温孵育20 min。滴加一抗(IL-17A抗体1∶200稀释，IL-6抗体1∶1 000稀释，IFN-γ抗体1∶500稀释)，4 ℃孵育过夜。PBS洗3次，每次3 min，二抗37 ℃孵育30 min。PBS洗3次，每次3 min，DAB显色液。避光显色，蒸馏水终止显色。苏木素染色10 min。纯水蓝化20 min。50%、70%、80%、95%和无水乙醇梯度脱水，每道2 min。二甲苯透明，中性树脂封片，晾干，拍照。

1.2.5结果判断

切片于低倍镜下观察，选择卵巢癌较密处就进一步观察。高倍镜下，观察5个视野，阳性表达为细胞质呈棕黄色。用Image.pro plus 6.0处理图片，获得吸光度(A)值。

1.2.6ELISA检测血清IL-17A、IL-6、IFN-γ水平

每孔加入50 μL标准品和样品，再加50 μL抗体Cocktail，室温孵育2 h。洗涤10 s×3次。加入100 μL TMB Development Solution避光孵育10 min。加入100 μL Stop Solution，1 min后在A450 nm处读数。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 不同卵巢组织的形态观察

对照组卵巢组织无明显异常，良性肿瘤组卵巢有部分炎性细胞浸润，卵巢癌组肿瘤细胞大小不均，形态各异，且排列杂乱无序，癌细胞核大且多呈卵圆形，核仁较为明显，核分裂相较多，可见少量核固缩，细胞分化程度偏低，见图1。

A、B：对照组；C、D：良性肿瘤组；E、F：卵巢癌组。

2.2 IL-17A在不同卵巢组织表达情况

IL-17A在对照组呈弱阳性，表达强度为0.147±0.025；在良性肿瘤组亦呈弱阳性，表达强度为0.159±0.028；在卵巢癌组呈强阳性，表达强度为0.386±0.024，3组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.3 ELISA检测血清IL-17A表达水平

对照组血清IL-17A表达水平为(31.99±5.69)pg/mL，良性肿瘤组为(33.99±7.12)pg/mL，卵巢癌组为(63.72±8.28)pg/mL，3组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与良性肿瘤组比较。

2.4 IL-6在不同卵巢组织中的表达情况

IL-6在对照组呈弱阳性，表达强度为0.148±0.033；在良性肿瘤组呈中等阳性，表达强度为0.257±0.026；在卵巢癌组呈强阳性，表达强度为0.410±0.033，3组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

2.5 ELISA检测血清IL-6表达水平

对照组血清IL-6表达水平为(27.08±8.54)pg/mL，良性肿瘤组为(55.53±9.22)pg/mL，卵巢癌组为(153.45±17.5)pg/mL，3组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图5。

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与良性肿瘤组比较。

2.6 IFN-γ在不同卵巢组织中的表达情况

IFN-γ在对照组呈强阳性，表达强度为0.398±0.025；在良性肿瘤组亦呈强阳性，但弱于对照组，表达强度为0.301±0.035；在卵巢癌组呈弱阳性，表达强度为0.144±0.036，3组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图6。

A、B：对照组；C、D：良性肿瘤组；E、F：卵巢癌组。

2.7 ELISA检测血清IFN-γ的表达水平

对照组血清IFN-γ的表达水平为(142.97±20.79)pg/mL，良性肿瘤组为(111.89±17.40)pg/mL，卵巢癌组为(78.47±16.03)pg/mL，3组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图7。

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与良性肿瘤组比较。

2.8 IL-17A、IL-6、IFN-γ的相关性分析

IL-17A和IL-6呈强正相关关系(r=0.991 8)，IL-17A和IFN-γ呈强负相关关系(r=-0.977 4)。

3 讨 论

现今，卵巢癌的早期诊断和治疗效果还不尽人意，虽然手术方式有所改进且化疗药物不断更新，但晚期卵巢癌患者的5年生存率并无明显提高。同时，卵巢癌的发生、发展机制仍不甚清楚，还需深入研究影响卵巢癌增殖、侵袭、转移和分化的相关因素及分子机制，为临床的早期诊断和治疗提供新的思路。

许多上皮性肿瘤均有一个重要标志，即潜在的慢性感染伴随持续的固有免疫细胞活化，该过程的发生常常早于疾病的发生并参与肿瘤的发生、发展[6]。而固有免疫细胞则是引起感染及炎症相关性肿瘤基质中的重要组分。而当前慢性持续性的炎症已成为恶性肿瘤新的热门标记性特征。因此，研究卵巢癌患者肿瘤微环境中的免疫和炎性反应是了解卵巢癌发生、发展的关键所在。

IL-17A是由CD4+T细胞中的辅助型T细胞(Th)17细胞亚群分泌的一种细胞因子，可以诱导某些细胞中TNF-α、IL-1、IL-6等促炎因子的表达，进而参与炎性反应、抗感染反应等。IL-17A的表达水平也被一系列因素调节，如被抗原呈递细胞分泌的IL-6和IL-1调节。另外，IFN-γ在IL-17A的调节中也起到重要作用，DMBA/TPA通过诱导IFN-γ的表达刺激IL-17A的分泌从而促进乳头瘤的进展。但在IFN-/-的小鼠中，B16黑色素瘤的生长较野生型小鼠明显增强，且IL-17A有更高的表达。由此推断IFN-γ可能在不同肿瘤类型中对IL-17A的表达起不同调节作用。现有研究表明IL-17A在多种肿瘤中表达升高，如乳腺癌[7]、胆囊癌[8]、非小细胞肺癌[9]等，且促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在本研究中，IL-17A在对照组、良性肿瘤组表达水平较低，且两组间无差异；而在卵巢癌组表达水平升高，这与IL-17A在多种肿瘤中的表达趋势一致。

IL-6来源广泛，单核巨噬细胞、活化的T细胞、B细胞等都可以产生IL-6。IL-6是机体免疫应答和炎性反应的重要调节因子，其在机体内的生物学作用与其表达水平间具有两面性。当IL-6处于低水平时，有利于机体的免疫调节；而当其处于高水平时，就会严重影响细胞因子间正常的协同作用，从而引起细胞因子功能紊乱，进而引发各种疾病。IL-6的过度产生在多种癌症细胞中普遍存在，同时在癌症患者中伴随着血清IL-6水平的明显上升。近些年国际国内研究表明，IL-6介导的信号通路与乳腺癌[10]、肝癌[11]、胃癌[12]等常见肿瘤的发生、发展均密切相关，且参与肿瘤的侵袭、转移、预后及复发[13]。此外，IL-6还可增加卵巢癌细胞的黏附性、趋化性和化学促进性及总的侵袭力[14]。本研究3组IL-6在卵巢组织和血清均有所表达，且随恶性程度加重呈递增趋势。这与IL-6处于低水平时，有利于机体的免疫调节，而在肿瘤中常常过度表达一致。

IFN-γ是多功能细胞因子，参与抗感染、抗肿瘤等多种生物学事件。IFN-γ一方面可以增强自然杀伤(NK)细胞和T细胞的活性，从而促进Th1型细胞因子的分泌，这有利于激活抗肿瘤免疫途径；另一方面高浓度IFN-γ或持续性低剂量的IFN-γ又有利于形成肿瘤细胞免疫逃逸微环境，说明IFN-γ对肿瘤的调控存在多面性。现研究一般认为当Th1功能较强时，机体的细胞免疫可有效抑制肿瘤细胞的活力[15]，反之亦然。本研究中，IFN-γ在对照组呈强阳性，在良性肿瘤组亦呈强阳性，但弱于对照组，而在卵巢癌组呈弱阳性，说明在卵巢癌中Th1功能较弱，肿瘤细胞活力较强。

综上所述，IL-17A、IL-6和IFN-γ参与了卵巢癌的发生，且三者间有一定的关联，有成为卵巢癌早期检测和分子靶向的可能，但三者间具体的作用机制，以及如何促进卵巢癌的发生还有待深入研究。